[發明專利]仔豬水腫病滅活疫苗的制備方法及其產品

無效

• 申請號: 201110202012.9
• 申請日: 2011-07-19
• 公開（公告）號: CN102266553A
• 公開（公告）日: 2011-12-07
• 發明（設計）人: 孟福強;曲海波;孫德君;付麗杰;丁國杰;張楊;王彬;柴華;王琪;鄭鐵鑫;田路路;孫建富;郝建偉;謝德炎
• 申請（專利權）人: 哈藥集團生物疫苗有限公司
• 主分類號: A61K39/108
• 分類號: A61K39/108;C12N1/20;A61P31/04;C12R1/19
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;余光軍

技術領域

本發明涉及一種滅活疫苗的制備方法，尤其涉及仔豬水腫病滅活疫苗的制備方法以及由該制備方法得到的滅活疫苗產品，屬于仔豬水腫病滅活疫苗的生產領域。

背景技術

仔豬水腫病(Edema?disease，ED)病原屬于腸桿菌科埃希菌屬大腸埃希菌種，產類志賀毒素大腸桿菌。研究證明，有25個O抗原血清型與仔豬水腫病發生有關，其中主要有O?2，O?8，O?138，O?139，O?141等O抗原血清型，這些菌株多具有溶血性，其中，C83684屬于O?139的一個種屬。在臨床上，該病主要引起仔豬眼瞼水腫和神經癥狀，部分仔豬伴有腹瀉癥狀，剖檢可見眼瞼、胃壁、腸系膜水腫，組織病變為器官漿液性炎癥及廣泛性小動脈炎癥。仔豬水腫病主要發生在斷乳后1-2周的仔豬，尤其在發育良好的仔豬群，造成很大的經濟損失，是斷奶仔豬危害較嚴重的疾病。此病分布于全世界，中國也常見報道，是多年來困擾中國養豬業的問題之一。雖然此病可采用抗生素及磺胺類藥物進行治療，但會造成藥物殘留，據現地調查90％以上的大型養豬場均采用接種疫苗的方式來防治該病。

目前，中國國內一些生物制品生產廠家生產的仔豬水腫病疫苗均為滅活疫苗。其主要的工藝方法如下：

1、制備一級斜面菌種：將大腸桿菌菌種稀釋接種營養肉湯平板，37℃培養22-24h；選典型菌落接種營養肉湯斜面培養基，37℃培養24h，得到一級斜面菌種；

2、制備二級菌種：取一級斜面菌種接種于營養肉湯基中37℃振蕩培養18-20h，得到二級菌種，備用；

3、菌液培養：將二級菌種接種到營養肉湯培養基中用生物發酵罐培養；37℃通氣培養18-20h，純檢確認無菌后，滅活，即得。

按照現有的方法進行生產所制備得到的仔豬水腫病滅活疫苗的培養菌數一般都在100-200億/ml。此外，現有的仔豬水腫病滅活疫苗的制備方法還存在培養基營養成分少，生產成本高，產量低等缺陷，有待改進。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是克服現有的仔豬水腫病滅活疫苗的制備方法中所普遍存在的培養菌數低、生產成本高等缺陷，提供一種新的仔豬水腫病滅活疫苗的制備方法，該制備方法具有培養基營養豐富，生產成本低，產量高等優點。

本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的：

一種仔豬水腫病滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟：

(1)、制備一級斜面菌種：將大腸桿菌菌種稀釋接種合成平板培養基，培養；選取所培養的典型菌落接種合成斜面培養基，培養，得到一級斜面菌種；

(2)、制備二級菌種：取一級斜面菌種接種于合成培養基中振蕩培養，得到二級菌種，備用；

(3)、菌液培養：將二級菌種接種到合成培養基中進行發酵培養；將發酵培養液滅活，即得。

其中，步驟(1)中所述的大腸桿菌菌種為大腸桿菌C83684菌種；所述的合成平板培養基或合成斜面培養基的成分包括：蒸餾水100ml、牛肉粉0.5g、酵母提取物0.5g、胰蛋白胨1g、氯化鈉1g、瓊脂粉1.5g、葡萄糖0.5g、DMEM0.1g；所述的培養優選在以下條件下進行：培養溫度為37℃，培養時間為22-24h。

優選的，步驟(1)中選10-20個所培養的典型菌落接種合成斜面培養基；

步驟(2)或步驟(3)中所述合成培養基的成分包括：蒸餾水3000ml、牛肉粉15g、酵母提取物15g、胰蛋白胨30g、氯化鈉30g、葡萄糖15g、DMEM?3g；其pH值為7.2-7.4。

步驟(2)中所述的振蕩培養優選在以下條件下進行：振蕩轉速為100-200r/min，培養溫度為37℃，培養時間為16h。

步驟(3)中所述的發酵培養條件優選為：培養溫度為37℃；轉速為100-200r/min；培養時間為12h；本發明人經過進一步的試驗發現，在發酵培養過程中，采用逐漸加大通氣量的方法，能夠顯著提高培養菌數。

本發明針對現有的仔豬水腫病滅活疫苗的制備方法所存在的培養基營養成分少，生產成本高，產量低等缺陷，改進培養基配方并優化了生產工藝，最終在培養基配方和培養方法上獲得突破，培養菌數相比于現有的方法有大幅度提高，平均達到了279.875億/ml，本發明方法培養時間縮短了8-10h，有效降低了生產成本。

具體實施方式