[發(fā)明專利]一種砷酸鋯鍵合磁性硅球的制備方法

無效

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• 申請(qǐng)日: 2011-07-19
• 公開（公告）號(hào): CN102350326A
• 公開（公告）日: 2012-02-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馮鈺锜;李小水
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢大學(xué)
• 主分類號(hào): B01J20/286
• 分類號(hào): B01J20/286;B01J20/30
• 代理公司: 武漢科皓知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 汪俊鋒

技術(shù)領(lǐng)域

????本發(fā)明一種砷酸鋯鍵合磁性硅球的制備方法，屬于有機(jī)合成領(lǐng)域，也屬于儀器分析領(lǐng)域。

背景技術(shù)

蛋白質(zhì)磷酸化修飾是指在蛋白質(zhì)激酶的催化下把ATP上的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的過程。它是生物界普遍存在的一種調(diào)控機(jī)制，調(diào)節(jié)著許多生命過程，如細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)，細(xì)胞生長、增殖、分化及凋亡等。鑒于它在細(xì)胞活動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用，探索蛋白質(zhì)磷酸化修飾過程的奧秘及其對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響已經(jīng)成為眾多生物化學(xué)家及蛋白質(zhì)組學(xué)家所關(guān)心的內(nèi)容。其中，磷酸化位點(diǎn)的鑒定和定量是首要任務(wù)。

蛋白質(zhì)磷酸化具有暫時(shí)性和可逆性，在一個(gè)特定時(shí)間點(diǎn)，并不是所有的氨基酸位點(diǎn)都處于磷酸化狀態(tài)。并且，相對(duì)于非磷酸化蛋白，磷酸化蛋白的豐度較低。因此，進(jìn)行磷酸化組學(xué)研究時(shí)，需要采用高靈敏度的技術(shù)。目前，質(zhì)譜是蛋白質(zhì)磷酸化分析最有力的工具。然而，由于高豐度非磷酸化肽段的干擾，磷酸化肽段的電離效率降低，導(dǎo)致信號(hào)強(qiáng)度較弱。因此，在質(zhì)譜分析之前，通常需要從蛋白酶解產(chǎn)物中選擇性地富集磷酸化肽段。

目前已發(fā)展出多種磷酸化蛋白質(zhì)和肽段的預(yù)富集方法，主要包括：（1）免疫親和富集法；（2）化學(xué)衍生法；（3）離子交換色譜法；（4）固定金屬親和色譜法（IMAC）；（5）金屬氧化物親和色譜法（MOAC）；（6）SIMAC技術(shù)；（7）磷酸鈣沉淀法等。其中，IMAC和MOAC是目前應(yīng)用最為廣泛的兩種方法。IMAC技術(shù)是利用固載在基底上的金屬離子對(duì)磷酸基團(tuán)的親和力來選擇性地富集磷酸化蛋白質(zhì)或肽段。其中，金屬離子的固載一般是通過鍵合到基底上的配體（又稱為螯合劑）的配位作用實(shí)現(xiàn)的，常見的配體有三羥甲基乙二胺（TED）、亞氨基二乙酸（IDA）、次氮基三乙酸（NTA）等。在這種方法中，螯合劑與金屬離子的作用力強(qiáng)弱對(duì)磷酸化多肽的富集效率有著很大的影響；螯合劑的作用力太弱容易導(dǎo)致金屬離子的流失，從而導(dǎo)致富集效率下降。因此，新配體的研究對(duì)于提高磷酸化多肽的富集效率具有重要意義。

2006年，有人報(bào)道了以磷酸根作為固載金屬離子的配體，將所得材料用來富集磷酸化肽段，并獲得很好的富集效果。此后，基于磷酸根為配體的IMAC技術(shù)得到了廣泛的關(guān)注和研究。然而，此過程中，磷酸根的獲得往往需要利用一些對(duì)人體毒性較大的物質(zhì)。因此，仍有必要去尋找制備方法簡單，合成原料安全廉價(jià)的固定相。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供了一種制備簡單、原料安全廉價(jià)的IMAC的固定相及其制備方法。

本發(fā)明提供的IMAC的固定相是：砷酸鋯鍵合磁性硅球。

其制備方法是：

首先合成含氨基的磁性硅球，然后通過戊二醛的橋聯(lián)作用，將對(duì)氨基苯砷酸鍵合到磁性硅球上，然后將亞胺還原為較穩(wěn)定的仲胺，最后將鋯離子通過砷酸根的螯合作用固載到磁性硅球上。

所述的含氨基的磁性硅球的制備方法是：首先通過二價(jià)鐵和三價(jià)鐵共沉淀合成磁性四氧化三鐵，然后通過St?ber方法合成磁性硅球，最后通過含氨基的硅烷偶聯(lián)劑在硅球表面鍵合氨基。

對(duì)氨基苯砷酸鍵合到磁性硅球上的方法是：首先利用氨基與醛的親核反應(yīng)，將戊二醛鍵合到氨基磁性硅球上，接著利用上述原理，將對(duì)氨基苯砷酸鍵合到磁性硅球。

還原過程的反應(yīng)條件是：氰基硼氫化鈉在室溫下，將亞胺還原為仲胺，反應(yīng)時(shí)間3?h。

鋯離子螯合作用的反應(yīng)條件是：室溫下，磁性硅球在0.1?mol/L的氧氯化鋯溶液中浸泡12小時(shí)。

本發(fā)明方法使用的原材料價(jià)格低廉無毒，制備方法簡單，所制備的材料可有效地應(yīng)用于磷酸化肽段的富集。

本發(fā)明制備砷酸鋯鍵合磁性硅球的路線如下所示。

首先利用二價(jià)鐵離子和三價(jià)鐵離子的共沉淀作用合成四氧化三鐵納米顆粒，然后利用St?ber方法合成磁性硅球。將含氨基的硅烷偶聯(lián)劑鍵合到磁性硅球表面之后，利用氨基與醛的親核反應(yīng)，在磁性硅球的表面引入醛基。最后仍根據(jù)上述原理，將對(duì)氨基苯砷酸鍵合到材料上，氰基硼氫化鈉將亞胺還原為仲胺，并且將鋯離子固載到砷酸上。將上述材料用于富集磷酸化多肽時(shí)，可獲得非常好的富集效果。此方法使用的原材料價(jià)格低廉，制備方法簡單。

附圖說明

圖1實(shí)施例6?β-酪蛋白胰蛋白酶解液經(jīng)砷酸鋯鍵合磁性微球富集后的MALDI-TOF-MS質(zhì)譜圖。

圖2實(shí)施例7?α-酪蛋白胰蛋白酶解液經(jīng)砷酸鋯鍵合磁性微球富集后的MALDI-TOF-MS質(zhì)譜圖。