[發明專利]五色熒光矩陣標準物及其制備方法與專用引物組合物

有效

• 申請號: 201110201443.3
• 申請日: 2011-07-18
• 公開（公告）號: CN102260671A
• 公開（公告）日: 2011-11-30
• 發明（設計）人: 葉健;趙興春
• 申請（專利權）人: 公安部物證鑒定中心
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12Q1/68;G01N27/447
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明屬于法醫遺傳學及生物技術領域，涉及一種五色熒光矩陣標準物質及其制備方法。

背景技術

近年來，隨著毛細管電泳技術、熒光復合擴增技術及多熒光檢測技術的應用，基因分型技術發展迅速，特別是在法醫學DNA檢驗領域得到了廣泛的應用。目前，基因分型技術主要是通過毛細管電泳設備及熒光檢測設備分析不同熒光標記的待測DNA片段的分子量，從而實現分型的目的。多種熒光分子標記技術使得DNA檢測的效率得到極大的提高，甚至可實現相同分子量DNA片段的區分。然而，利用這類儀器分析分子量時需要一個熒光矩陣標準物質來進行不同熒光的劃分，也就是熒光矩陣標準物質(Matrix?Standard)。

目前，在國內DNA檢測實驗室最常見的檢測設備主要是ABI310、3100、3100-Avant、3130和3130xl型遺傳分析儀，內置不同的檢測模式，不同的檢測模式對應不同的熒光染料組合。常用的熒光染料及其組合有：四色組合5-FAM、JOE、NED、ROX(AB公司)，FL、JOE、TAMRA、CXR(Promega公司)；五色組合6-FAM、VIC、NED、PET、LIZ(AB公司)。各組合不同顏色會互相重疊干擾。通過制備熒光標志物，在遺傳分析儀上生成正確的Matrix文件給予熒光信號收集和分析時的熒光識別，隨之檢測信號經過軟件處理，計算互相重疊的不同顏色的光譜，并且各顏色通道之間互不干擾，對評估多色熒光系統是非常關鍵的。不同的熒光標記就必須建立不同的熒光標準物。

發明內容

本發明的目的在于提供一種擴增五色熒光矩陣標準物質的引物組合物。

本發明提供的引物組合物由不同顏色熒光染料標記過的如下5對引物組成：由序列表中序列6所示的DNA和序列表中序列7所示的DNA組成的引物對1，由序列表中序列8所示的DNA和序列表中序列9所示的DNA組成的引物對2，由序列表中序列10所示的DNA和序列表中序列11所示的DNA組成的引物對3，由序列表中序列12所示的DNA和序列表中序列13所示的DNA組成的引物對4，由序列表中序列14所示的DNA和序列表中序列15所示的DNA組成的引物對5。

所述引物組合物中，每對引物對中的兩條引物之間的摩爾比為1∶1；

所述引物對1、引物對2、引物對3、引物對4和引物對5的摩爾比為如下1)或2)：

1)(0.3-0.5)∶(0.1-0.3)∶(0.5-0.7)∶(0.2-0.4)∶(0.2-0.4)；優選摩爾比為0.4∶0.2∶0.6∶0.3∶0.3；

2)0.4∶0.2∶0.6∶0.3∶0.3。

上述不同顏色熒光染料在每對引物的5’端進行標記；不同顏色熒光染料優選為紅色、橙色、黃色、綠色或藍色熒光染料，更優選是FAM、HEX、TAMAR、TET或ROX。

所述引物對1、引物對2、引物對3、引物對4和引物對5整體包裝或均單獨包裝。

本發明的另一目的在于提供一種制備五色熒光矩陣標準物質的方法。

所述方法包括如下步驟：

用任一上述的引物組合物中的引物對1、引物對2、引物對3、引物對4和引物對5在PCR體系中一次擴增出序列表中序列1、序列2、序列3、序列4和序列5所示的5個DNA片段，得到五色熒光矩陣標準物質。

上述PCR體系中的模板是9947A?DNA。

上述PCR體系中擴增條件是：95℃預變性10min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環；最后60℃延伸60min。

上述的方法制備得到的五色熒光矩陣標準物質屬于本發明的保護范圍之內。

上述的熒光矩陣標準物質在毛細管電泳的熒光校準中的應用也屬于本發明的保護范圍之內。

與傳統的四色熒光矩陣標準物質相比，本發明提供的熒光矩陣標準物質制備方法能夠在一個反應體系內同時獲得含有五種熒光產物的熒光標準物，無需進行單色熒光標準物質的混合和調配即可直接應用于熒光校正。該方法極大的簡化了熒光標準物的制備工藝流程，避免了復雜繁瑣的操作。

附圖說明

圖1為實施例1引物對1擴增得到的產物的毛細管電泳檢測圖。

圖2為實施例1引物對2擴增得到的產物的毛細管電泳檢測圖。

圖3為實施例1引物對3擴增得到的產物的毛細管電泳檢測圖。

圖4為實施例1引物對4擴增得到的產物的毛細管電泳檢測圖。