[發(fā)明專利]abl基因多態(tài)性的檢測用探針和其用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110201116.8
• 申請日: 2011-07-12
• 公開（公告）號: CN102329857A
• 公開（公告）日: 2012-01-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 細(xì)見敏也
• 申請（專利權(quán)）人: 愛科來株式會(huì)社
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 中原信達(dá)知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11219
• 代理人: 楊青;樊衛(wèi)民

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于檢測與白血病相關(guān)的abl基因的多態(tài)性的探針和其用途。?

背景技術(shù)

白血病是由骨髓中的造血干細(xì)胞癌化而引起的疾病。已知其中慢性粒細(xì)胞白血病(chronic?myeloid?leukemia：CML)的發(fā)病原因在于9號染色體和22號染色體的易位而形成的bcr-abl融合基因，其治療中廣泛使用作為ABL激酶抑制劑的伊馬替尼等。然而，該abl基因(包括前述融合基因中的abl基因)中存在點(diǎn)突變時(shí)，存在對伊馬替尼表現(xiàn)出耐受性的問題，這種情況下，治療中需要增加伊馬替尼給藥量、換成其它治療藥物、改為骨髓移植等等。因此，白血病特別是CML的治療中，檢測abl基因中有無點(diǎn)突變是非常重要的。?

作為abl基因中的點(diǎn)突變的檢測方法，可以列舉出：對abl基因變異，通過RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增、克隆后進(jìn)行序列解析的方法(PNAS?August?6，2002?vol.99?no.16?10700-10705)；用PCR-RFLP法對abl基因變異進(jìn)行檢測的方法(Leukemia(2002)16，2190-2196)；用DHPLC法對abl基因變異進(jìn)行檢測、序列解析的方法(Clin?Cancer?Res?2006；12(24)December?15，2006)等。然而，PNAS?2002中所述的方法在實(shí)驗(yàn)操作方面需要專業(yè)知識和技能，難以自動(dòng)化。此外，實(shí)驗(yàn)操作方面也需要花費(fèi)功夫，至獲得結(jié)果為止需要數(shù)天。Leukemia?2002中所述的方法操作也繁雜，至獲得結(jié)果為止需要1天左右。此外，有擴(kuò)增產(chǎn)物污染其它反應(yīng)之虞(發(fā)生污染)。且難以自動(dòng)化。Clin?Cancer?Res?2006中所述的方法操作也繁雜，難以自動(dòng)化。此外，DHPLC法難以區(qū)別突變型，需要通過測序法等另行對突變型進(jìn)行檢測。?

由這樣的問題出發(fā)，近年正在進(jìn)行利用熔解曲線分析(Tm分析)的檢測，來作為基因多態(tài)性的檢測方法(日本特開2001-286300，日本特開2002-119291)。其為如下方法，即，使用與含有檢測目的基因多態(tài)性的檢測對象序列互補(bǔ)的探針，形成檢測試樣的目標(biāo)單鏈DNA和前述探針的雜交體(雙鏈DNA)，對該雜交產(chǎn)物實(shí)施加熱處理，通過吸光度等信號的測定，來檢測隨溫度上升的雜交體的解離(熔解)，基于該檢測結(jié)果確定Tm值，從而判斷有無目的多態(tài)性。在雜交產(chǎn)物的同源性越高時(shí)，Tm值越高，在同源性越低時(shí)，Tm值越低。因此，對含有目的多態(tài)性的檢測對象序列和與其互補(bǔ)的探針的雜交產(chǎn)物預(yù)先求出Tm值(評價(jià)基準(zhǔn)值)，測定檢測試樣的目標(biāo)單鏈DNA和前述探針的Tm值(測定值)，若測定值與評價(jià)基準(zhǔn)值相同則可以判斷為匹配，即目標(biāo)DNA中存在目的多態(tài)性，若測定值低于評價(jià)基準(zhǔn)值則可以判斷為錯(cuò)配，即目標(biāo)DNA中不存在目的多態(tài)性。?

然而，使用這樣的Tm分析的檢測方法，存在靈敏度低這樣的問題。在對白血病患者的血細(xì)胞來源DNA進(jìn)行點(diǎn)突變檢測時(shí)，這特別成問題(日本特表2004-537992)。即，即使是一個(gè)CML患者的血液，其血細(xì)胞中也包含abl基因發(fā)生點(diǎn)突變的基因(變異基因)和未發(fā)生突變的基因(正常基因)，兩者的不同僅在于點(diǎn)突變即一個(gè)堿基的序列。這樣，會(huì)發(fā)生如下現(xiàn)象：用于檢測點(diǎn)突變的探針與含有點(diǎn)突變的變異序列(檢測對象序列)雜交(匹配)，還與不含點(diǎn)突變的正常序列(非檢測對象序列)進(jìn)行雜交(錯(cuò)配)。這種情況下，利用Tm分析制作表示信號強(qiáng)度和溫度的關(guān)系的熔解曲線時(shí)存在如下問題：匹配的變異序列所對應(yīng)的高溫側(cè)的峰由于錯(cuò)配的正常序列所對應(yīng)的低溫側(cè)的峰的存在而難以檢測。即，就現(xiàn)有的探針而言，即使在含有變異的變異序列存在的情況下，也由于不含變異的正常序列的存在而變得難以檢測，存在檢測靈敏度降低的問題。?

WO2008/018305中記載了在利用Tm分析的檢測方法中使用的、對?abl基因中的點(diǎn)突變即A758T(Y253F)、G756C(Q250E)、G763A(E255K)、和A758T(Y253F)進(jìn)行檢測的探針。此外，日本特開2008-199965中記載了對A730G(M244V)、G749A(G250E)、A943G(T315A)、C944T(T315I)、C951G(F317L)、T1052C(M351T)、A1064G(E355G)、T1075G(F359V)、和A1187G(H396R)進(jìn)行檢測的探針。然而，對T1076G(F359C)、T757C(Y253H)、A764T(E255V)、和G895C/T(V299L)進(jìn)行檢測的探針在所有文獻(xiàn)中均沒有記載。?

發(fā)明內(nèi)容