[發明專利]一種用于制備抗肝臟腫瘤標志物CK-19抗體的多肽序列、多克隆抗體與應用

有效

• 申請號: 201110200696.9
• 申請日: 2011-07-18
• 公開（公告）號: CN102336814A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發明（設計）人: 陳立勇;徐偉文;李明
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C07K16/06;G01N33/574
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛

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技術領域

????本發明涉及檢測肝癌標志物CK-19用的兔多克隆抗體，具體地說，涉及一種抗肝臟腫瘤標志物CK-19的多肽抗體的制備及其應用。

背景技術

細胞角蛋白（Keratin,?type?I?cytoskeletal）是細胞體的中間絲，根據其分子量和等電點不同可分為20種不同類型。在胚胎肝細胞中表達CK8、CK18、CK-19，隨著肝臟的分化，CK-19在正常肝細胞不表達，只在膽管中表達。CK-19對膽管上皮和膽管細胞癌（ICC）具有特異性染色，陽性率達77%~100%，是目前診斷ICC最好的免疫組化標志物之一。當肝細胞發生癌變時，有些癌細胞又重新表達CK-19，部分為分子結構不完整的CK-19，且表達程度與細胞的分化程度呈負相關。當細胞出現壞死時，CK-19以溶解片段的形式釋放于血清中，能在血液中檢出，檢測指標為細胞角質素偏低抗原。Nagai等報道，在70例肝癌患者中，33例外周血CK-19升高，在同時檢測CK-19和AFP的患者中，有12.3%的患者CK-19升高而AFP正常。兩者聯合檢測對診斷有一定的互補性。Ding?SJ等發現CK-19在高轉移力細胞株中高表達，且隨著轉移力的升高表達量亦呈上升趨勢。李雁等進一步探索了CK-19與肝癌患者臨床病理指標的關系，表明血清CK-19升高與HCC分化程度低，血管侵襲力強，臨床病期晚有一定的關系。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種可特異性識別人肝癌細胞表達的CK-19的多克隆抗體。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種用于制備抗肝臟腫瘤標志物CK-19抗體的多肽序列，其氨基酸序列如SEQ?NO.1所示。

為便于與載體蛋白偶聯，在上述多肽序列的C端連接一個半胱氨酸。

本發明選擇了CK-19蛋白N端14肽作為候選多肽，并用人工方法進行多肽合成制備免疫原。

上述多肽序列免疫動物可獲得多克隆抗體，所述多克隆抗體能用于制備肝癌診斷藥物。

本發明用上述免疫原免疫新西蘭兔，獲得可特異性識別人肝癌細胞表達的CK-19的多克隆抗體。

與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：

本發明對CK-19蛋白氨基酸序列的二級結構、免疫原性、親疏水性、表面可及性等進行分析，確定合適的一段肽序列進行人工合成；將合成的多肽與馬來酰亞氨活化的載體mcKLH偶聯，將此偶聯產物進行脫鹽柱純化后免疫新西蘭兔；經過多次免疫的兔血清用ELISA法對抗體效價進行檢測，效價達理想值后收集免疫兔血清，并用Protein?G蛋白純化柱純化抗體；對純化后抗體進行ELISA、western?bot等鑒定。鑒定結果表明該多克隆抗體可特異性識別CK-19蛋白，可用于檢測肝癌細胞表達的CK-19蛋白，為肝癌診斷提供幫助，并能指導其臨床預后判斷和治療方案的選擇。

附圖說明

圖1是抗CK-19多克隆抗體經protein?G凝膠柱純化后經SDS-PAGE電泳?(12%)檢測結果。M:?蛋白Marker：Lane?1：上樣峰；Lane?2：流穿峰；Lane?3：平衡峰；Lane?4：洗脫峰。

圖2是本發明中的抗CK-19多克隆抗體的western-blot鑒定結果。上樣為HepG2細胞（人肝癌細胞系）裂解液。

具體實施方式

本發明設計和人工合成CK-19多肽抗原，與馬來酰胺活化的匙孔血藍載體蛋白（KLH）偶聯，經脫鹽純化后免疫新西蘭兔，通過多次免疫及ELISA效價檢測后，采集兔血清并經protein?G凝膠純化柱純化。該多克隆抗體經過ELISA、western?blot等鑒定，可特異性識別人肝癌細胞表達的CK-19蛋白，為肝癌診斷提供幫助，并能指導其臨床預后判斷和治療方案的選擇。

下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明，而不用于限制本發明的范圍。在不背離本發明的技術解決方案的前提下，對本發明所作的本領域普通技術人員容易實現的任何改動都將落入本發明的權利要求范圍之內。

實施例1：CK-19多肽的設計及合成

1.?CK-19氨基酸序列

根據GenBank獲得人CK-19氨基酸序列?(P08727)：如SEQ?NO.2所示。

結果：人CK-19蛋白含有400氨基酸。

2.?http://www.uniprot.org/uniprot在線分析CK-19結構域（表1）：

表1