[發(fā)明專利]玉米淹水脅迫響應(yīng)zmERF5基因啟動子

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110199205.3
• 申請日: 2011-07-15
• 公開（公告）號: CN102876674A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 杜何為;黃敏;張祖新;陳威;黃育剛;范金香;吳闖
• 申請（專利權(quán)）人: 長江大學(xué)
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/10;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 北京市中實友知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11013
• 代理人: 熊成香

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及玉米淹水脅迫響應(yīng)zmERF5基因啟動子，屬植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

我國每年受洪澇災(zāi)害的農(nóng)田面積平均為956萬公頃，其中嚴(yán)重的年份，受災(zāi)面積達(dá)1500萬公頃以上。在亞洲地區(qū)，洪澇災(zāi)害給玉米的生產(chǎn)造成了很大的損失，僅南亞，每年超過15％的玉米種植面積遭受不同程度的危害。在印度，洪澇災(zāi)害造成玉米每年減產(chǎn)25-30％。因我國南方降雨量豐富、排灌系統(tǒng)不完善等原因，低洼地區(qū)的春玉米經(jīng)常遭受澇漬害，導(dǎo)致玉米嚴(yán)重減產(chǎn)。澇漬害已成為我國南方玉米高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的主要制約因子之一。因此，克隆玉米淹水脅迫響應(yīng)基因及其啟動子，對闡明玉米淹水脅迫響應(yīng)形成的分子機理以及玉米和其他旱生作物耐澇漬的遺傳改良，具有十分重要的理論價值和實踐意義。

ERF基因是參與植物非生物脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵基因之一，是水稻、深水稻和擬南芥淹水脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵基因。因此，克隆玉米ERF基因的啟動子，有助于闡明玉米耐漬性形成的分子機制，同時為玉米及其他旱生作物的耐漬遺傳改良提供理論指導(dǎo)。然而，玉米ERF啟動子的克隆，目前，尚未見有報道。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的在于提供玉米淹水脅迫響應(yīng)zmERF5基因啟動子，并提供zmERF5基因啟動子在植物耐漬遺傳改良中的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

1、玉米zmERF5基因的獲得

根據(jù)已知的玉米基因組信息，使用煙草ERF2蛋白的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域高度保守的蛋白質(zhì)序列，進行同源比對分析，電子克隆出121個ERF基因。通過與擬南芥、水稻、煙草等其他植物ERF基因的比較分析，剔除48個假陽性，獲得了73個ERF基因，分別命名為zmERF1--zmERF73。玉米自交系Hz32的耐漬性較強，而Mo17耐漬性較弱，在玉米3葉1心期，分別對Hz32和Mo17進行0、4、12h的淹水處理，并利用real-time?PCR對73個ERF基因在各處理根系的表達(dá)進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)zmERF5基因在Mo17及Hz32根系受淹水誘導(dǎo)高效表達(dá)，結(jié)果也暗示zmERF5基因的啟動子是淹水脅迫響應(yīng)的誘導(dǎo)型啟動子。

2、玉米自交系Mo17葉片總DNA的提取

取玉米葉片5.0g于液氮中研磨，轉(zhuǎn)入50ml離心管中。加預(yù)熱至95℃的CTAB緩沖液(1.17MNaCL、0.0016M?EDTA-8.0，0.835M?Ttis-7.5，1.6％CTAB，1％β-疏基乙醇)10ml，混勻。在65℃水浴鍋內(nèi)反應(yīng)90分鐘，不時輕搖離心管。取出離心管，待冷至室溫后，加入等體積氯仿∶異醇(24∶1)，小心搖動試管10分鐘。8000rpm離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)至另一50ml離心管中。加2/3體積異丙醇，小心混勻，將棉絮狀DNA轉(zhuǎn)入盛10ml?70％乙醇的50ml離心管中，浸泡12小時。倒掉70％乙醇，將DNA晾干，加入1ml?TE溶解。待DNA完全溶解后，轉(zhuǎn)入2.0ml離心管中，加入10μl?10mg/ml?RNaseA，混勻；在37℃下，溫育2小時。再用1ml苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提一次，8000rpm離心10分鐘。將上清液轉(zhuǎn)入2.0ml離心管中，加入1/10體積的3M?NaAC(PH5.2)，2/3體積異丙醇沉淀DNA。將棉絮狀DNA轉(zhuǎn)入2.0ml離心管中，用70％乙醇洗滌一次，短暫離心，使DNA貼壁，倒去70％乙醇，晾干DNA。待DNA晾干后，加入0.5ml?T.E溶液，完全溶解DNA，于-20℃長期保存。

3、zmERF5基因啟動子的克隆

根據(jù)玉米自交系B73?zmERF5基因的啟動子序列，設(shè)計一對特異引物，左引物：5′TGGAAGCAAGGCCACACAACTAA?3′，右引物：5′TAAATTGAATTTTAGATGTTGCCT?3′。分別以Mo17、Hz32的DNA作為模板，進行PCR擴增。PCR擴增反應(yīng)體系為：2.5μl?10×PCR緩沖液，2μl?10mM?dNTPs，1μl?10mM特異引物，1μl?10mM特異右引物，1單位Taq酶，40ng模板DNA，總體積25μl。PCR擴增程序為：95℃3分鐘；95℃1分鐘，61℃1分鐘，72℃2分鐘30秒，循環(huán)35次；72℃7分鐘；4℃30分鐘。PCR擴增產(chǎn)物于1％瓊脂糖凝膠中120伏直流電壓電泳45分鐘，使用北京全式金生物技術(shù)有限公司的凝膠回收試劑盒，回收特異DNA片段，并將該DNA片段連接到pGEM-Teasy載體上，進行DNA測序。

4、轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建