[發明專利]植物莖尖轉化方法及其專用工具

無效

• 申請號: 201110197273.6
• 申請日: 2011-07-14
• 公開（公告）號: CN102321662A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 李銀心;呂素蓮
• 申請（專利權）人: 中國科學院植物研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N1/21;A01H5/00
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種植物莖尖轉化方法及其專用工具。

背景技術

植物遺傳轉化方法就是通過特定的方式將外源基因導入到受體細胞內，使之發生定向的、永久的遺傳變異。目前，人們已經建立了多種轉化系統。對大多數遺傳轉化系統而言，遺傳轉化方法是遺傳轉化系統的關鍵環節，決定著轉化的成敗及效率。用于植物的轉化方法有許多：農桿菌介導法，基因槍法，電擊法、PEG法等。農桿菌介導法和基因槍法已成為目前用于遺傳轉化的主要方法。

過去認為受農桿菌宿主范圍限制，農桿菌介導的遺傳轉化僅限于雙子葉植物。最早報道的采用農桿菌介導法轉化成功的植物單子葉植物是石刁柏，之后相繼在水稻、玉米、大麥、甘蔗等重要作物中獲得了農桿菌介導的轉基因植株，并有充足的分子和遺傳證據。雖然大多數單子葉植物不是農桿菌的天然宿主，但隨著對農桿菌轉化植物細胞原理的深入認識，通過添加外源信號物質如乙酰丁香酮(AS)等也可以實現農桿菌對單子葉植物的轉化。由于農桿菌轉化利用天然的整合系統實現DNA的轉移，該法具有轉基因拷貝數低、遺傳穩定、成本低廉等優點使農桿菌成為大多數遺傳轉化的首選方法。

植物受體的選擇是遺傳轉化系統的另一重要因素。目前農桿菌轉化的植物受體主要包括幼胚及其胚性愈傷組織、葉盤、子葉、子葉節、下胚軸等外植體。這些受體都需要經過脫分化過程形成愈傷組織，然后經過再分化再生植株。組織培養和遺傳轉化能否成功在很大程度上取決于受體基因型，絕大多數具有重要經濟價值的基因型難以利用，植株再生頻率很低，并且組織培養過程中易發生體細胞無性系變異。因此，選擇合適的外植體作為農桿菌轉化的受體，建立不受基因型限制的遺傳轉化體系仍是目前研究的重點之一。

近年來，利用離體莖尖分生組織直接再生系統進行的轉基因研究工作逐漸增多，并取得重要進展。1988年，McCabe等用基因槍轉化大豆離體莖尖獲得了轉基因植株。1991年Gould等用玉米離體莖尖與農桿菌共培養獲得了轉化植株及子代。Zapata等(1999)和Satyavathi等(2002)分別用農桿菌介導法轉化棉花離體莖尖都獲得了轉基因植株。離體莖尖分生組織不需要脫分化過程，莖尖轉化后直接再生植株，這使轉化周期大大縮短，并一定程度上打破了基因型限制，因此顯示出良好的應用前景。

農桿菌介導的小麥遺傳轉化是一道難題。據統計，在2002年前獲得小麥轉基因植株的報道中，基因槍法占90％左右，其他方法僅占10％。1997年，Cheng等利用農桿菌介導法轉化小麥成功，標志著小麥遺傳轉化的另一個里程碑。由于小麥離體培養受基因型的影響大、多數品種植株再生頻率低、對農桿菌感染不敏感、組織培養過程中易發生體細胞無性系變異等原因，使得通過農桿菌介導的遺傳轉化進展慢，批量獲得轉基因小麥植株仍受基因型限制很大，以致小麥基因工程研究遠落后于其它主要農作物。另外，小麥的基因組有1.7×10¹⁰bp，是水稻基因組的40倍，是玉米基因組的6倍，是擬南芥基因組的100倍，巨大的基因組導致轉基因植株的分子鑒定難度大，特別是Southern雜交分析，影響了轉基因小麥的后代研究。影響小麥遺傳轉化的因素如小麥基因型、外植體類型、浸染及共培養時間、農桿菌菌株與篩選劑等近年來都得到了廣泛研究，但轉化效率明顯低于其它主要農作物的。

鹽角草(Salicornia?europaea)是屬于藜科的一種肉質化真鹽生植物，廣泛分布在沿海和內陸鹽湖附近，能夠積累高到干重50％的NaCl，被認為是世界上最耐鹽的一種高等植物。鹽角草具有發展為蔬菜、油料作物及飼料作物的潛力。建立高效穩定的鹽角草遺傳轉化體系對于挖掘研究其抗逆基因功能及其自身的形狀改良具有重要意義。Shi等(2006)以成熟胚為外植體誘導愈傷組織并實現了植株再生，建立了鹽角草的體外再生體系。然而該體系的愈傷誘導率和植株再生率很低，很難用于批量遺傳轉化。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種培育轉基因植物的方法。

本發明提供的培育轉基因植物的方法，包括如下步驟：

1)刺傷目的植物的莖尖生長點，得到處理后目的植物；

2)用含有目的DNA的重組農桿菌菌液侵染步驟1)得到的所述處理后目的植物，得到浸染后幼苗；

3)培養步驟2)得到的浸染后幼苗，得到含有所述目的DNA的轉基因植物。

步驟1)中，所述刺傷采用下述的金屬刷；

步驟2)中，所述含有目的DNA的重組農桿菌菌液按照如下方法制備：

A)將所述目的DNA通過重組載體導入根癌農桿菌得到重組農桿菌；