[發(fā)明專利]右旋糖酐酶組成型表達工程菌的構建方法及酶的制備方法

有效

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• 申請日: 2011-07-14
• 公開（公告）號: CN102268449A
• 公開（公告）日: 2011-12-07
• 發(fā)明（設計）人: 曾練強;梁達奉;黃曾慰;蟻細苗;陳龍軍;吳兆鵬;李錦榮;李雨虹;張遠平;黃玉南
• 申請（專利權）人: 廣州甘蔗糖業(yè)研究所
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N9/46;C12R1/84
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 譚英強

技術領域

本發(fā)明涉及基因工程和蛋白質的分泌表達領域，尤其涉及組成型分泌表達蛋白酶的工程菌株的構建，以及蛋白酶的制備方法。

背景技術

甘蔗如受到刀傷或壓傷、病蟲害、火燒、霜凍或在收割后放置長時間，都會受到腸膜明串珠菌(Leuconostoc?mesnteroides)、鏈球菌屬(Streptococcus)等微生物的感染而形成α-葡聚糖（右旋糖酐）。在蔗汁中α-葡聚糖濃度可高達1％，嚴重的會生成白色的固體狀物質（俗稱“蔗飯”）。α-葡聚糖的出現(xiàn)不僅會造成糖份的直接損失，它的存在使制糖工藝過程困難增加，造成的糖分損失是糖分直接損失的3—5?倍。因此，如何減少α-葡聚糖以及降低其負面影響是我國糖業(yè)界一個迫切需要解決的問題。

目前我國糖廠主要采用殺菌劑預防α-葡聚糖的產生，葡聚糖在普通的蔗汁澄清工藝中除去不多，在蒸發(fā)濃縮時部分形成懸浮物，將糖漿澄清也可將它們除去一部分。試驗數(shù)據(jù)表明，糖漿澄清前含葡聚糖0.031％，總多糖0.073％，澄清后分別降至0.025％和0.048％，去除率分別為19％及34％。原糖中葡聚糖大部分（80%）存在于晶體內部，蜜洗也很難將它除去，對煉糖不利。

α-葡聚糖酶（右旋糖酐酶）是一種具有催化α-葡聚糖降解的活性蛋白質，可以在較溫和的條件下，除去α-葡聚糖，將其轉化成小分子的單糖或寡糖，降低粘度、加快沉降過濾速度、減少蒸煮時間、降低蒸汽消耗、提高糖的品質等，增加蔗糖的回收率。右旋糖酐酶在制糖中的作用效果非常顯著，據(jù)制糖專家James?報道，在制糖過程中加入右旋糖酐酶后，糖分回收提高3—5%，糖的質量也明顯提高。右旋糖酐酶的應用能夠顯著的提升制糖產業(yè)的品質和競爭力。酶法清凈工藝對于提高效率、降低能耗和減少排污有顯著效果，是典型的綠色化學處理工藝。高效右旋糖酐酶及復合酶制劑的開發(fā)成功，能夠實現(xiàn)節(jié)能降耗、提升品質、提升競爭力，可有效消除α-葡聚糖在制糖行業(yè)的負面影響，無疑對制糖行業(yè)清潔生產、技術進步及促進產業(yè)發(fā)展具有顯著的積極意義。

目前右旋糖酐酶主要是從薄青霉（Penicillium?lilacinum）和細麗毛殼屬（Chaetomium?sp.）等菌株培養(yǎng)得到；亦有構建工程菌的報道，但制備的右旋糖酐酶不能很好地適應制糖過程中的溫度和pH，且制備過程均需采用誘導劑，有的是成本較高的右旋糖酐，有的使用易燃易爆有毒的甲醇，不利于安全生產和安全使用。本發(fā)明采用畢赤酵母組成型表達右旋糖酐酶，發(fā)酵過程無需誘導劑，且發(fā)酵周期短，降低了成本，提高了生產和使用安全性。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種右旋糖酐酶的組成型表達工程菌株構建方法及右旋糖酐酶的制備方法。

本發(fā)明所采取的技術方案是：

一種右旋糖酐酶的組成型表達工程菌株構建方法，包括如下步驟：

（1）?????將右旋糖酐酶基因插入到表達載體pGAPZαA的三磷酸甘油醛脫氫酶（GAP）啟動子的下游多克隆位點，構建重組質粒pGAPZαA-dex；

（2）?????將重組質粒pGAPZαA-dex線性化，轉化到畢赤酵母KM71H，涂板培養(yǎng)，篩選陽性克隆菌KM71H-dex。

優(yōu)選的，使用AvrII單酶切使重組質粒線性化。

優(yōu)選的，在含有Zeocin的YPD平板上培養(yǎng)克隆菌。

一種制備右旋糖酐酶的方法，流程如下：

（1）?????將權利要求1得到的陽性克隆菌接種到培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)；

（2）?????待培養(yǎng)基中的甘油含量低于0.3%時，起始甘油流加；

（3）?????分離提純右旋糖酐酶。

優(yōu)選的，培養(yǎng)基含有如下成分：10×Basal?salt+250×PTM1+3%(w/v)甘油。

優(yōu)選的，培養(yǎng)條件：溫度25～30℃，pH5.0～7.0，溶氧量大于20%。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明通過以三磷酸甘油醛脫氫酶（GAP）啟動子作為外源基因啟動子，實現(xiàn)了目的蛋白的組成型表達，構建了能高效分泌表達右旋糖酐酶的工程菌株；并以廉價碳源為原料，在各類碳源的培養(yǎng)基上就可以表達，在發(fā)酵過程中無需使用易燃易爆的甲醇誘導，消除生產安全隱患，實現(xiàn)右旋糖酐酶的發(fā)酵工藝放大，工藝條件安全簡單，最大限度地降低成本。

附圖說明

圖1為PCR擴增右旋糖酐酶基因的電泳圖；

圖2為表達載體pGAPZαA-dex的雙酶切鑒定圖；

圖3為本發(fā)明構建成功的表達載體pGAPZαA-dex的結構示意圖；