[發明專利]支持CHO高密度懸浮生長的無血清無蛋白全化學成分界定的培養基

無效

• 申請號: 201110196413.8
• 申請日: 2011-07-14
• 公開（公告）號: CN102876626A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發明（設計）人: 陳宜頂
• 申請（專利權）人: 寧波安柯普頓生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/02
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 楊立

技術領域

本發明涉及一種支持動物細胞培養的無血清培養基，尤其是一種支持CHO高密度懸浮生長的無血清無蛋白全化學成分界定的培養基，支持CHO細胞高密度懸浮培養的同時具有化學成分界定的特點，屬于細胞工程領域。

背景技術

基因工程蛋白的表達從上世紀80年代在國外興起，迄今已經接近30年，并被廣泛應用于生物學研究、醫藥研究行業。尤其由于生物醫藥行業特別是以治療單抗為產品的生物技術公司在90年代后異軍突起，使得該行業每年以超過50％的復合增長率高速發展。世界范圍內，在已經獲批和正在報批的重組治療性蛋白中，超過70-80％基于動物細胞培養生產，在所有基于動物細胞培養的蛋白藥物生產中，CHO(中國倉鼠卵巢細胞)的應用最為廣泛，占到了已經批準蛋白藥物的70％以上，以及正在申報臨床項目的80％以上。

CHO細胞與其他動物細胞比，外源蛋白易于合成及分泌到培養基中；正確組裝和修飾翻譯后的蛋白使之和天然蛋白接近；易于放大，便于工業化高密度培養；應用于臨床藥物生產的歷史長，安全性高；因此，CHO細胞的培養便變得十分重要，其中培養基的設計與優化又成為重中之重。從早期的有血清培養基過渡到無血清培養基及現在國際上至為推崇的化學成分界定培養基，無一不是將生產工藝中不安全、不穩定、不經濟和不夠有效的組分盡量調整為沒有病毒/外源因子污染，批次重復性高，成本低廉和支持更高的細胞密度及蛋白表達方向。

國外在最近幾年隨著動物細胞培養與表達技術的發展，已經出現了以Life?Tehnologies，Thermofisher等公司為代表的一些試劑公司開發出用于CHO細胞高密度懸浮培養的培養基，包括普通無血清培養基，無蛋白培養基及化學成分界定培養基，但由于屬于各公司的核心商業秘密，秘而不宣。

國內近些年來也開始陸續針對CHO細胞開發了多種無血清培養基，但大多數均是在已有基本培養基如DMEM，DMEM/F12，IMDM等基礎上加入各種維生素，生長因子，轉鐵蛋白，蛋白水解物及微量元素，成份復雜，營養平衡程度差且基本上均含有蛋白或其水解產物類較難于質控，影響下游純化的組分。同時細胞培養表現一般，批次培養很少超過5百萬細胞每毫升的密度。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提供了一種支持CHO高密度懸浮生長的無血清無蛋白全化學成分界定的培養基，引入更多包括微量元素在內的組分，替代一般培養基設計中所必需的生長因子如胰島素和轉鐵蛋白，并通過代謝分析和統計學實驗設計，讓各營養組分更加平衡。最終獲得一個沒有任何非界定成份的培養基，同時支持CHO細胞更好的生長和更短的細胞擴增倍增時間。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：

1)利用已有文獻報道設計簡化培養基骨架配方；

2)選擇添加可以替代生長因子、轉鐵蛋白和提高細胞生長表現組分；

3)利用統計學實驗設計確定各個組分的最佳劑量；

基于以上考慮，本發明的培養基主要由以下幾方面的組分構成：

氨基酸：作為蛋白/多肽合成的前體和合成其他生物大分子的中間體，同時也產生代謝能量；

無機鹽：NaC?l維持滲透壓平衡，協調共同轉運有機大分子進入細胞；K⁺，Ca²⁺，Mg²⁺，Zn²⁺等離子則參予代謝與信號轉導以及促進貼壁和細胞增殖；各種陰離子(SO₄^2-，NO₃^-等)則主要用于調節轉細胞膜勢能或作為含硫或氮元素有機分子的前體；

維生素：維生素在細胞代謝中主要作為以下細胞功能有機催化劑功能。如碳分子的代謝，轉氨作用，羧化與去羧基化作用，氧化磷酸化；

碳水化合物：葡萄糖是細胞培養中需要的主要碳水化合物，用作細胞代謝的主要能量來源，及合成DNA等大分子的碳源；丙酮酸鈉和肌醇也常常用來縮短細胞的中間代謝；

微量元素：很多微量金屬離子在特定濃度范圍有很明顯的對細胞的生長和蛋白表達的促進作用和抑制作用。

除此外，培養基中還加入了酚紅用作培養基pH的指示劑，和F-68作為懸浮細胞培養中用于保護細胞免受剪切力傷害的表面活性劑。

根據將以上各類物質對細胞生長的不同作用，本發明將以上類別的物質按以下濃度進行設置：

氨基酸的組分和用量：

無機鹽的組分和用量：

微量元素的組分和用量：