[發(fā)明專利]一種纖維素降解梭菌的高效基因失活方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110189083.X
• 申請日: 2011-07-07
• 公開（公告）號: CN102864162A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發(fā)明（設計）人: 崔球;崔古貞;洪偉;劉亞君
• 申請（專利權）人: 中國科學院青島生物能源與過程研究所
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12R1/145
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發(fā)明涉及菌株改造領域，具體涉及降解纖維素產(chǎn)乙醇梭菌遺傳改造領域。

背景技術

隨著能源資源的日趨短缺以及環(huán)境污染問題日益突出，加快新能源的開發(fā)和利用，開辟新型能源供應，對于緩解國家能源供需矛盾，有效保護生態(tài)環(huán)境，實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。地球上豐富的生物資源，為新型生物能源的開發(fā)和利用提供了前提和保障。與傳統(tǒng)的發(fā)酵淀粉或糖類生產(chǎn)生物燃料相比，以纖維素為原料生產(chǎn)生物乙醇具有原料廣泛、成本低、溫室氣體排放少等優(yōu)點，因此纖維素生物能源的開發(fā)和利用將能夠彌補化石能源的不足。

整合生物技術(Consolidated?bioprocessing?CBP)在纖維素生物質能源轉化中具有無可替代的優(yōu)越性，它可以同步實現(xiàn)纖維素酶的生產(chǎn)、纖維素的水解和發(fā)酵。纖維素降解梭菌(Clostridium?cellulolyticum)是一種嗜中溫革蘭氏陽性厭氧菌，能夠一步實現(xiàn)纖維素酶的生產(chǎn)、纖維素的水解和發(fā)酵，以及乙醇、乙酸、乳酸、CO₂和H₂等產(chǎn)物的生產(chǎn)的過程，因此是通過CBP生產(chǎn)纖維素乙醇的模式菌株。

纖維素降解梭菌于上世紀八十年代首次從腐草中分離得到。自此，對該菌的研究主要集中在探索與纖維素降解相關基因功能，纖維小體結構與功能及相關酶的酶學性質等方面。直到2000年，實驗人員才初步研究了該菌的遺傳轉化系統(tǒng)，為下一步遺傳改造奠定了基礎。根據(jù)已有的轉化方法，研究人員實現(xiàn)了外源基因在纖維素降解梭菌中的表達，從而改造其代謝途徑，提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。如，通過遺傳工程的方法在該菌中補充完整的異丁醇合成途徑，使纖維降解梭菌能夠發(fā)酵纖維素生產(chǎn)異丁醇。2009年，纖維素降解梭菌的基因組得到測序，使得對其在遺傳水平上的有針對性的研究成為可能。然而，有關纖維素降解梭菌遺傳改造方面的研究至今仍停留在表達自身或外源基因的水平上，而采用基因失活的方法對其進行遺傳改造仍無人問津。通過分析可知，問題癥結所在正是纖維素降解梭菌中進行基因失活方法的缺乏。本發(fā)明提供了一種在纖維素降解梭菌體內(nèi)成功進行基因失活的方法，且此方法在纖維素降解梭菌中進行基因失活的效率可高達95％以上。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種對纖維素降解梭菌(Clostridium?cellulolyticum)進行有針對性地高效地基因失活的方法。

本發(fā)明所使用的標準菌株是Clostridium?cellulolyticum?ATCC35319(H10)，本發(fā)明所使用的基因轉移方法及基因失活載體是根據(jù)文獻報道、本實驗室進行相應改造而來。本發(fā)明主要是根據(jù)細菌二類內(nèi)含子能夠定向、高效的插入到基因特定靶位點的特性，對所選定的基因進行插入失活而達到基因失活的目的。本發(fā)明以纖維素降解梭菌Ccel2866基因(編碼產(chǎn)物為限制性內(nèi)切酶Msp?I，識別酶切位點為CCGG)為失活對象，首次成功實現(xiàn)了纖維素降解梭菌的基因失活。

主要內(nèi)容包括：

1.一種纖維素降解梭菌高效基因失活的方法。所述方法包括：利用細菌二型內(nèi)含子進行插入失活所述纖維素降解梭菌細胞內(nèi)基因的步驟。

2.按照以上1的方法，其特征在于所述纖維素降解梭菌是能夠利用纖維素產(chǎn)乙醇的梭菌。

3.按照以上2的方法，其特征在于所述利用纖維素產(chǎn)乙醇梭菌包括纖維素降解梭菌(Clostriduum?cellulolyticum)、食纖維素梭菌(Clostridium?cellulovorans)和溶紙梭菌(Clostridium?papyrosolvens)。

4.按照以上1-3的方法，其特征在于所述定向失活方法包括基于二型內(nèi)含子L1.ltrB的插入失活。

5.按照以上4的方法，其特征在于所述利用纖維素產(chǎn)乙醇梭菌與遺傳轉化相關基因的插入失活。

6.按照以上5的方法，其所述與遺傳轉化相關的基因包括限制性修飾系統(tǒng)的基因以及與纖維素降解相關基因。

7.按照以上6的方法，其所述限制性修飾系統(tǒng)的基因包括I、II、III和IV型限制性內(nèi)切酶編碼基因。

附圖說明

圖1，Ccel2866基因中二類內(nèi)含子(intron)插入示意圖。

圖2，Ccel2866基因插入PCR驗證。WT，C.cellulolyticum野生型菌株為模板；NC，陰性對照，未加模板；plasmid，質粒為模板；泳道1-4及7-9，使用Primer?1和2擴增產(chǎn)物；5-6，使用引物Ccel2866-297/298s-EBS2和Primer?2擴增產(chǎn)物