[發明專利]一種添加蛋白酶抑制劑提高過氧化氫酶產量的方法

無效

• 申請號: 201110187904.6
• 申請日: 2011-07-06
• 公開（公告）號: CN102250849A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發明（設計）人: 陳堅;堵國成;李江華;劉龍;馮卓林
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/08
• 分類號: C12N9/08;C12R1/125
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

技術領域

一種添加蛋白酶抑制劑提高過氧化氫酶產量的方法，屬于發酵工程技術領域。

背景技術

過氧化氫酶（Catalase，簡稱CAT），能夠催化H₂O₂分解為H₂O和O₂，被廣泛用于食品消毒、臨床分析、醫學診斷以及紡織、造紙、制漿等工業。CAT在棉織物前處理過程中的主要作用是去除織物漂白廢液中殘余的H₂O₂，以消除對后續染色工序的影響。大多數過氧化氫酶由4個相同的亞單位組成，分子量在240?kDa左右。近年來隨著過氧化氫酶在紡織、造紙、制漿等行業的普遍應用，市場對過氧化氫酶的需求大幅增長。

過氧化氫酶產量的提高，對酶的生產和應用非常重要，可以降低生產的成本，獲得較高的經濟效益，滿足工業應用的需求，服務國計民生。

六偏磷酸鈉是一種無機鹽，它可以抑制蛋白酶，保護過氧化氫酶不被分解，是一種價格低廉的保護劑，通過添加六偏磷酸鈉，提高過氧化氫酶的產量，尚未見文獻報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種提高過氧化氫酶產量的方法。

為解決上述技術問題，提供如下技術方案：在過氧化氫酶發酵生產30-40小時添加1-10?g/L蛋白酶抑制劑。

所述過氧化氫酶生產菌株優選枯草芽孢桿菌Bacillus?sp.WSHDZ-01，中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC?NO：M206062，詳見中國專利：一種堿性過氧化氫酶高產菌及用該菌株發酵法生產堿性過氧化氫酶，專利號200610040898.0。

所述蛋白酶抑制劑優選六偏磷酸鈉。

培養基：

斜面培養基：6°麥芽汁，瓊脂1.5%-2.0?%，pH?7.5。

液體種子培養基：6°麥芽汁，pH?7.5。

基本發酵培養基：

葡萄糖?10?g/L,?NaNO₃?5?g/L,?MgSO₄·7H₂O?0.5?g/L，Na₂HPO₄?9.52?g/L，KH₂PO₄?0.6?g/L，FeSO₄·7H₂O?0.0025?g/L，pH?7.0-7.5。

培養方法:

斜面培養：接種后的斜面置于37oC的恒溫培養箱中培養10-20?h，4oC下冷藏保藏，定期轉接。

液體種子培養方法：取一環斜面菌體接種至裝有50?ml種子培養基的250?ml三角瓶中培養，HYG-Ⅱ型回轉式恒溫調速搖瓶柜的轉速為200?r/min溫度設為37?oC，培養12-14?h。

基礎搖瓶發酵培養：按照6?%(體積比)的接種量將培養12-14?h的種子培養液，接種至裝有80?ml基礎發酵培養基的500?ml三角瓶中進行發酵培養，發酵時間為36-40?h，溫度為37oC，搖床轉速為200?r/min。

發酵罐培養：電腦在線控制檢測發酵罐KFT-3?L中，裝發酵培養基1.8?L，接種量為5%的體積比，攪拌轉速為400?rpm，溫度采用分階段控制策略，0~10?h?37?℃，11~20?h?35?℃，21h~發酵結束32?℃。通氣量為1.0?vvm，發酵周期為48-53小時。

過氧化氫酶活力的測定方法：

采用分光光度法在37?℃下測定。反應總體積為3?mL，含0.1?mL酶液樣品和2.9?mL含10?mmol/L的50?mmol/L?KH₂PO₄-K₂HPO₄緩沖液(pH?7.0)，H₂O₂的分解速率用UV-2450型紫外可見光分光光度計在240?nm下測定。酶活定義為：在37?℃下，分解H₂O₂?1?μmol/min所需的酶量為一個酶活單位。

本發明的有益效果：

1）在不改變現有工藝的條件下，過氧化氫酶產量大幅提高；

2）發酵液的儲藏穩定性提高，降低了分離純化過程中酶活的損失；

3）原料價格低廉、方法操作簡單，易于工業化生產中應用。

具體實施方式

對照實施例：