[發明專利]一種腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關凋亡配體變體及其應用

在審

• 申請號: 201110187700.2
• 申請日: 2011-07-06
• 公開（公告）號: CN102863537A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發明（設計）人: 華子春;曹林;唐波
• 申請（專利權）人: 江蘇靶標生物醫藥研究所有限公司;常州南京大學高新技術研究院
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K1/22;C07K1/18;C12N15/62;C12N15/70;A61K38/17;A61K48/00;A61K47/48;A61P35/00
• 代理公司: 常州佰業騰飛專利代理事務所(普通合伙) 32231
• 代理人: 金輝

技術領域

本發明屬基因工程生物技術領域，涉及一種腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關凋亡配體變體的制備及其藥學應用。

背景技術

腫瘤壞死因子相關凋亡配體(TRAIL)是腫瘤壞死因子超家族中的一個成員。與腫瘤壞死因子超家族其它成員類似，可溶性形式的腫瘤壞死因子相關配體以三聚體形式與靶細胞表面三聚體化的受體分子結合而發揮生物學功能。腫瘤壞死因子相關凋亡配體誘導凋亡的作用是通過與腫瘤細胞上的死亡受體4(DR4)和死亡受體5(DR5)的相互作用傳遞死亡信號而實現的。雖然腫瘤壞死因子超家族的其它成員由于具有全身性的毒副作用而使應用受到限制，但是腫瘤壞死因子相關凋亡配體是一個相對安全、具有腫瘤選擇性的抗腫瘤物質。腫瘤壞死因子相關凋亡配體在體外能誘導多種腫瘤細胞和癌化細胞的凋亡，并且在小鼠的移植異種腫瘤，包括結腸癌、乳腺癌、多重性骨髓瘤、神經膠質瘤、前列腺癌等多種模型中具有較好的抗腫瘤活性。尤其重要的是，在小鼠和非人類靈長類動物中全身給藥時，TRAIL表現出較小或沒有毒性。基于以上原因，重組腫瘤壞死因子相關凋亡配體已經在進行腫瘤治療的臨床研究。

但是近來一些報道顯示：除了誘導腫瘤細胞的凋亡外，腫瘤壞死因子相關凋亡配體還涉及到天然免疫和獲得性免疫，和自身免疫性疾病相關。例如，近來的研究報道表明它在胸腺的發育過程中調節負向選擇或凋亡胸腺細胞，并且在誘發自體免疫性疾病如I型糖尿病中起重要作用。此外，腫瘤壞死因子相關凋亡配體的受體在整個身體廣泛性表達，腫瘤壞死因子相關凋亡配體還參與肝細胞死亡和肝炎。因此在臨床上重復、全身性使用大劑量外源性腫瘤壞死因子相關凋亡配體蛋白可能會導致不可預料的免疫結果。這些報道使科學家非常擔心腫瘤壞死因子相關凋亡配體在臨床中重復和持久使用時產生潛在的副作用。如何在腫瘤治療時，避免腫瘤壞死因子相關凋亡配體對其它組織的毒副作用，這是腫瘤壞死因子相關凋亡配體(TRAIL)在潛在的臨床應用中面臨的難題。

發明內容

為克服野生型腫瘤壞死因子相關凋亡配體在腫瘤治療方面所面臨的缺陷，本發明目的在于：發明一種具有腫瘤組織靶向性的腫瘤壞死因子相關凋亡配體變體，將其靶向輸送到腫瘤組織中，以此提高腫瘤壞死因子相關凋亡配體的療效，降低其毒副作用，從而能在治療腫瘤疾病中得到應用。

氨基酞酶N(Aminopeptidase?N，APN)/CD13蛋白是一種經研究證明只表達在腫瘤新生血管內皮細胞上的蛋白質(Pasqualini?R，Koivunen?E，Kain?R等，Cancer?Res.2000，60：722-727)，處于靜止狀態的正常血管內皮細胞很少表達CD13，近年來發現氨基酞酶N/CD13也與腫瘤的轉移和預后相關聯(Haraguchi?N，Ishii?H，Mimori?K等，J?Clin?Invest.2010，120：3326-3339；Fontijn?D，DuyndamMC，van?Berkel?MP等，Br?J?Cancer.2006，94：1627-1636；Fujii?H，NakajimaM，Saiki?I等，Clin?Exp?Metastasis.1995，13：337-344)。

為達到實現腫瘤壞死因子相關凋亡配體腫瘤組織靶向輸送，提高其抗腫瘤療效、降低其毒副作用的目的，本發明是通過以下技術方案來實現的：一種具有腫瘤組織靶向性的腫瘤壞死因子相關凋亡配體變體，是具有序列表中序列1氨基酸殘基序列的蛋白質，它是通過基因工程方法構建由CD13的配體、連接肽、腫瘤壞死因子相關凋亡配體組成的腫瘤壞死因子相關凋亡配體變體融合蛋白質，即利用常規基因工程方法通過人工合成或者克隆構建腫瘤壞死因子相關凋亡配體變體的編碼基因、可溶性地重組表達和簡便地分離純化。所述CD13的配體可以是一種含有NGR序列的多肽，優選為一種帶有環狀結構的、含有NGR序列的多肽，例如短肽CNGRC。

上述的CD13的配體和腫瘤壞死因子相關凋亡配體所構成的腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關凋亡配體變體之間可以添加一段具有柔性結構的、不含支鏈氨基酸的短肽，其中，短肽為1-25個氨基酸殘基，主要由甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸等不含支鏈的氨基酸組成。

上述的CD13的配體放置于腫瘤壞死因子相關凋亡配體N端時，在CD13的配體之前增加一個不含支鏈的氨基酸，主要是丙氨酸或甘氨酸，以防表達時出現的N端氨基酸降解，影響CD13配體的功能。