[發明專利]ZnSe量子點標記過氧化氫酶熒光探針的制備方法

有效

• 申請號: 201110186499.6
• 申請日: 2011-07-05
• 公開（公告）號: CN102305780A
• 公開（公告）日: 2012-01-04
• 發明（設計）人: 周培疆;陳馳;馬蓉
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術領域??

本發明涉及量子點的生物應用技術領域，更具體涉及一種ZnSe量子點標記過氧化氫酶熒光探針的制備方法，該探針可用于檢測污染物、毒物及與過氧化氫酶的作用效應。

背景技術??

有機相合成的量子點不具備親水性，因此不能直接應用于生物體系，必須對其進行表面修飾，其操作過程復雜，條件要求高。水相合成法制備的量子點能夠直接用于生物探針，對其研究愈來愈受到重視，有關這方面的研究進展很快。但由于水相合成的量子點所選用的配體多為簡單的巰基化合物，表面的活性基團比較少且表面積很小，難以與目標物質結合，因此水相量子點的直接應用存在局限性。因此，將量子點與生物大分子結合既增大了量子點的表面積，又增加了量子點表面活性基團，克服了水相量子點的應用局限性。

發明內容??

本發明的目的是在于提供了一種ZnSe量子點標記過氧化氫酶熒光探針的制備方法，該方法工藝快速簡單，工藝參數易控制。該探針水溶性和生物相容性好，檢測功能應用廣泛，性價比高，在保持了過氧化氫酶（CAT）活性的同時，修飾了量子點表面，使其具有更高的熒光強度。且完全采取綠色原料，因此可以更好的應用于生物活體檢測。

為了實現上述的目的，本發明采用以下技術措施：

其技術構思是：一種ZnSe量子點標記牛血清蛋白熒光探針，它包括ZnSe量子點(自制，請見A~E步驟)、過氧化氫酶(CAT，SIGMA-ALORICH)、乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide?hydroehloide?簡稱EDC，99%?上海共價化學)；2-巰基乙醇(化學純，中國醫藥集團上海化學試劑公司)；其余為Tris緩沖溶液。

所述的ZnSe量子點中，醋酸鋅(Zn(Ac)₂·2H₂O，上海美興化工有限公司)、硒氫化鉀(KH₄Se，請見A，B步驟)、還原型谷胱甘肽(GSH，?Japan)的摩爾比率分別為?1：1/15~1/10：1.6~1.8，95℃條件下加熱45~60min。

所述的Tris緩沖溶液pH值為6.8-7.6。

一種ZnSe量子點標記過氧化氫酶熒光探針的制備方法，其步驟如下：

A、??????????????制備硒氫化鉀(KH₄Se)?溶液：通過硼氫化鉀(KBH₄，天津市天大化學試劑廠)還原硒粉(Se，天津市科密歐化學試劑開發中心)制備，反應方程式如下：

???????4KBH₄?+?2Se?+?7H₂O?→?2KH₄Se?+?K₂B₄O₇?+11H₂↑

B、?分別稱取0.03006g硼氫化鉀和0.00789g硒粉于具塞試管中，向其中加入2mL高純水，塞上塞子，于1~5℃下反應0.5~1.5h，得無色透明液體，為0.05mol/L的硒氫化鉀；

C、分別稱取0.10975~0.16463g醋酸鋅晶體和0.24586~0.41489g還原型谷胱甘肽，溶解于200mL無氧高純水中；

D、在150~300轉/min的攪拌和不斷通入高純氬氣的條件下，加入1mL0.05mol/L的硒氫化鉀，用5mol/L的氫氧化鈉溶液調節溶液pH值為10-11，待其混合，得到一種混合液；

E、將步驟D的混合液以每罐50ml分裝于聚四氟乙烯消解罐中，于93-97℃下微波加熱60~75min，KH₄Se、Zn(Ac)₂·2H₂O，還原型谷胱甘肽的摩爾比率分別為?1/15~1/10：1：1.6~1.8。

F、取4mL制備好的濃度為1?mmol/L?ZnSe量子點，1mL配制好的1×10^-9mol/L的過氧化氫酶溶液，再加入0.2mL0.24g/L的乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽于40℃恒溫振蕩0.5-1h，使ZnSe量子點通過偶聯劑乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽與過氧化氫酶溶液進行充分反應，加入0.3mL、0.1mol/L的2-巰基乙醇終止交聯，制得量子點標記過氧化氫酶熒光探針，該探針在保持了酶活性的同時，使量子點的熒光強度得到了很大的提高。

所述的ZnSe量子點如何制備的過程請見步驟A~E。