[發明專利]利用大腸桿菌生產腫瘤轉移抑制蛋白GDI2的純化方法

無效

• 申請號: 201110185827.0
• 申請日: 2011-07-04
• 公開（公告）號: CN102286581A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發明（設計）人: 孫愛友;魏東芝;王學東;徐瑞;董玉國;倪克奉;王麗華
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K1/22;C12R1/19
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 林君如

技術領域

本發明涉及一種人腫瘤轉移抑制蛋白GDI2在大腸桿菌中的表達與純化的方法，尤其是涉及一種利用大腸桿菌高效制備高純度天然腫瘤轉移抑制蛋白GDI2的方法。

背景技術

Rho-GDP解離抑制因子2(Rho-GDP?dissociation?inhibitor?2，GDI2)，最早由Leffers等人發現，由201個氨基酸構成，是Rho?GDP解離抑制因子(RhoGDI)家族的成員之一。近年來大量的研究證明RhoGDI2蛋白在人體中擔負著阻止癌細胞在整個機體內擴散的任務，該蛋白能夠非常有效的抑制腫瘤細胞的侵襲及轉移，且內皮素1(ET-1)和神經介素U(NmU)可能為其作用靶點。GDI2在人體內經caspase-1酶切后21kDa的GDI2短肽通過失巢凋亡機制(Anoikis)能夠大幅度增加癌細胞的凋亡，從而抑制了細胞的轉移。作為一種具有良好應用前景的的抗癌藥物蛋白，提高GDI2蛋白的工業化水平對于生產企業至關重要。

目前，在重組蛋白分離純化方面，利用重組標簽進行純化的技術，是一種被廣泛使用的方法。該方法利用標簽與純化柱中填料的特異親和作用，從而實現蛋白的有效純化，且獲得的蛋白純度較高，操作簡單。但是該技術也有其瓶頸：純化得到得到的目的蛋白仍然帶有重組標簽，所以需要利用外源蛋白酶來切除純化標簽，不僅增加了純化過程的工作強度，延長了純化時間，更重要的是外源蛋白酶價格昂貴，極大地增加了純化成本。所以如何解決重組標簽的切除問題，從而縮短純化時間，降低工作強度，并降低純化成本，對重組蛋白的工業化生產相當重要。

發明內容

本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種解決當前利用重組標簽進行蛋白純化過程中出現的標簽切除這個關鍵問題，而提供的一種操作簡單、效率高的利用大腸桿菌生產腫瘤轉移抑制蛋白GDI2的純化方法。

本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：

利用大腸桿菌生產腫瘤轉移抑制蛋白GDI2的純化方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

(1)將單個新鮮的大腸桿菌工程菌單克隆接種于含有氨芐青霉素的LB培養基中，在37℃、200rpm/min的條件下振蕩培養過夜，然后再將其接種于優化過的LB培養基中在相同條件下繼續培養，當OD₆₀₀＝0.6-0.8時，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)進行誘導，在37℃、200rpm/min的條件下繼續培養6h；

(2)離心收集細胞，加入裂解液，超聲破碎，收集上清液，利用Proinity?eXect純化柱對目的蛋白進行純化，使用Band?Buffer沖洗Proinity?eXect純化柱，再將上清液按2ml/min的速度上柱，接著使用Wash?Buffer沖洗柱上雜蛋白，加入EloutionBuffrt孵育1h，最后收集穿透液，即獲得純化的腫瘤轉移抑制蛋白GDI2，蛋白純度可達到97％以上，蛋白回收率可達80％。

表達質粒為pPAL7-GDI2，其中含有編碼人腫瘤轉移抑制蛋白GDI2的基因序列與eXect純化標簽。

所述的LB培養基的組成包括以下組分及含量：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl?10g/L，利用3mol/L鹽酸溶液和3mol/L?NaOH溶液將培養基的pH值調整至7.0，氨芐青霉素的含量為50μg/ml。

所述的優化過的LB培養基的組成包括以下組分及含量：蛋白胨10-15g/L、酵母粉5-10g/L、葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O)2-5g/L、NaCl?1-2g/L、NaH₂PO₄·12H₂O?2-4g/L、Na₂HPO₄·3H₂O7-9g/L、K₂HPO₄·3H₂O?4-6g/L、ZnSO₄·7H₂O?0.1-0.2g/L、MgSO₄·7H₂O1-2g/L，溶劑為蒸餾水，利用3mol/L鹽酸溶液和3mol/L?NaOH溶液將培養基的pH值調整至7.0。

所述的裂解液為0.1M?PBS緩沖液，pH為7.2。

所述的Proinity?eXect純化柱為含有固定化枯草桿菌酶(subtilisin)填料的親和層析柱。