[發(fā)明專利]一種利用體細胞核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因克隆水牛的方法無效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201110185317.3 | 申請日： | 2011-07-04 |
| 公開（公告）號： | CN102250954A | 公開（公告）日： | 2011-11-23 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 石德順;陸鳳花;羅嬋;李楠;韋英明;劉慶友;李湘萍;蔣建榮 | 申請（專利權(quán)）人： | 廣西大學(xué) |
| 主分類號： | C12N15/873 | 分類號： | C12N15/873;C12N15/85;A01K67/027 |
| 代理公司： | 廣西南寧公平專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 45104 | 代理人： | 黃永校 |
| 地址： | 530004 廣西壯族*** | 國省代碼： | 廣西;45 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 利用 體細胞 移植 技術(shù) 生產(chǎn) 轉(zhuǎn)基因 克隆 水牛 方法 | ||
1.一種利用體細胞核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因克隆水牛的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：
(1)水牛胎兒成纖維細胞的轉(zhuǎn)染與篩選：傳代培養(yǎng)至三代的水牛胎兒成纖維細胞使用線性質(zhì)粒DNA(pCE-EGFP-IRES-neo)采用電穿孔法進行轉(zhuǎn)染，然后用DMEM+10％胎牛血清+600μg/ml?G418的培養(yǎng)液篩選培養(yǎng)6～10d后，挑取細胞數(shù)超過60個的細胞集落擴大培養(yǎng)，獲得G418抗性的轉(zhuǎn)EGFP基因細胞，
(2)轉(zhuǎn)基因克隆水牛的生產(chǎn)：水牛卵母細胞在體外成熟培養(yǎng)22h后，選擇有第一極體的卵母細胞于裝有Spindle-view系統(tǒng)的倒置顯微鏡下進行去核獲得受體卵母細胞，供體細胞為轉(zhuǎn)染篩選后且通過接觸抑制法培養(yǎng)的水牛胎兒成纖維細胞，經(jīng)倒置熒光顯微鏡觀察確證表達EGFP后注入到去核的卵母細胞卵周隙中，然后采用安裝在顯微操作儀上可活動的距離為0.2mm的兩根鉑金絲微電極針進行電融合，融合后的核移植重構(gòu)胚用離子霉素處理5min，再用2mmol/L的6-二甲氨基嘌呤培養(yǎng)3h進行化學(xué)激活處理，然后置于含顆粒細胞單層的微滴中共培養(yǎng)6～7d，將獲得的克隆囊胚在熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達情況，篩選出表達EGFP的轉(zhuǎn)基因克隆囊胚移植到受體母水牛的子宮角中，受體水牛經(jīng)妊娠足月后產(chǎn)下犢牛，在紫外燈照射下，這些轉(zhuǎn)基因克隆水牛犢頭部和四肢明顯均表達有EGFP標(biāo)記基因。
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