[發(fā)明專利]一種白紋伊蚊的Apyrase編碼基因及其蛋白制備方法和用途

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110182827.5
• 申請日: 2011-06-30
• 公開（公告）號: CN102851264A
• 公開（公告）日: 2013-01-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 程訓(xùn)佳;付永鋒;董芳;周承俊
• 申請（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/55;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;C12Q1/44;A61K38/46;A61P7/02
• 代理公司: 上海元一成知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種白紋伊蚊的Apyrase編碼基因及其蛋白制備方法和用途。

背景技術(shù)

文獻(xiàn)公開了Apyrase是一種水解酶，可將三磷酸核苷酸(ATP)和雙磷酸核苷酸(ADP)水解成為單磷酸核苷酸和無機(jī)磷。在植物、節(jié)肢動物和脊椎動物中均發(fā)現(xiàn)有apyrase的存在。有研究報道，許多看似無關(guān)的蛋白如熱休克蛋白、肌動蛋白和糖激酶也具有水解ATP和ADP的活性，Valenzuela認(rèn)為這些蛋白是趨同進(jìn)化的產(chǎn)物。一般來說，依據(jù)氨基酸序列和底物特異性，核苷酸水解酶可分為三大類：外生型、CD73淋巴細(xì)胞蛋白家族來源的5’-核苷酸酶和吸血節(jié)肢動物來源的核苷酸水解酶。外生型的核苷酸水解酶在Mg2+或Ca2+存在下酶活性較好，有5個不同的且高度保守的區(qū)域，1、4和5區(qū)是特異性的活性區(qū)。吸血節(jié)肢動物來源的核苷酸水解酶是Ca2+依賴的。研究還顯示，吸血昆蟲分泌的apyrase蛋白可以水解從破損的內(nèi)皮細(xì)胞或血小板中釋放的ATP及ADP，進(jìn)而可以起到抑制凝血的作用，可以作為抗血栓的藥物。

蚊的Apyrase蛋白在雌蚊(非雄蚊)唾液腺中含量豐富，其作用是抑制凝血，有助于其吸血。此外，研究證實蚊唾液腺中的Apyrase蛋白是不同蚊種的共同過敏原，可誘發(fā)人體產(chǎn)生速發(fā)型超敏反應(yīng)，如瘙癢的風(fēng)團(tuán)和周圍的紅暈；或者遲發(fā)型超敏反應(yīng)，如硬化性的丘疹，是蚊的主要過敏原。

白紋伊蚊(Aedes?albopitus，又稱亞洲虎蚊)是幾乎呈全球分布的蚊種。其叮咬能夠誘發(fā)速發(fā)型超敏反應(yīng)，如瘙癢的風(fēng)團(tuán)和周圍的紅暈；或者遲發(fā)型超敏反應(yīng)，如硬化性的丘疹；蚊子叮咬過敏的患者還會出現(xiàn)較大的皮膚局部反應(yīng)甚至全身多臟器的過敏反應(yīng)，包括全身性蕁麻疹，血管性水腫，哮喘，惡心，嘔吐，哮喘等過敏性反應(yīng)和表現(xiàn)，因此蚊子叮咬不僅很大程度上影響人們的生活質(zhì)量，甚至?xí){人的生命。

目前臨床上對蚊過敏患者的診斷采用的是傳統(tǒng)的蚊體浸出液，其含有多種抗原成分，且相對效價和特異性抗原水平存在明顯的差異，很難進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化定量，容易引起患者出現(xiàn)診斷性過敏反應(yīng)，因此限制了對其診治應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于通過基因工程手段，從白紋伊蚊的唾液腺獲得Apyrase的編碼基因，構(gòu)建表達(dá)載體，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)重組白紋伊蚊Apyrase。

本發(fā)明提供了一種白紋伊蚊Apyrase蛋白及其編碼基因，然而產(chǎn)生本發(fā)明的基因序列的方法不受特別的限制。

本發(fā)明所述的白紋伊蚊Apyrase的編碼基因如SEQ1列出基因序列，其中SEQ1中1～75核苷酸序列編碼信號肽，76～1692核苷酸序列編碼白紋伊蚊Apyrase成熟肽。成熟白紋伊蚊Apyrase的氨基酸序列如SEQ2列出的氨基酸序列。

本發(fā)明提供了一種質(zhì)粒載體，含有編碼成熟白紋伊蚊Apyrase的基因片段。本發(fā)明的質(zhì)粒不受特別限制，優(yōu)選pET19b。

表達(dá)本發(fā)明的成熟白紋伊蚊Apyrase的宿主細(xì)胞構(gòu)成了本發(fā)明的一個部分。

本發(fā)明提供了一種能夠表達(dá)白紋伊蚊成熟Apyrase的大腸桿菌BL21Star(DE3)pLysS，它能表達(dá)本發(fā)明的白紋伊蚊的成熟Apyrase。本發(fā)明的宿主細(xì)胞不受特別的限制。

本發(fā)明所制備重組白紋伊蚊成熟Apyrase鑒定的方法不受特別限制，如聚丙烯酰胺凝膠電泳、Western?blotting、皮膚敏感試驗、血小板凝集試驗等。

本發(fā)明的第二個目的在于提供含有如前所述的白紋伊蚊成熟Apyrase用于蚊子過敏的診斷試劑。

本發(fā)明的第三個目的在于提供含有如前所述的白紋伊蚊成熟Apyrase為活性成分的藥物組合物，可用于抑制血小板凝集的抗血栓藥物。

本發(fā)明從雌性的白紋伊蚊的唾液腺中提取總RNA，并從中得到Apyrase的編碼基因，從而構(gòu)建表達(dá)載體。轉(zhuǎn)入大腸桿菌誘導(dǎo)后，重組白紋伊蚊的Apyrase以包涵體形式在大腸桿菌中高效表達(dá)，經(jīng)過簡單的洗滌后，可以獲得高純度的蛋白。以谷胱甘肽還原系統(tǒng)對其進(jìn)行復(fù)性后，可獲得具有生物學(xué)活性的可溶性重組白紋伊蚊的Apyrase，可用于白紋伊蚊叮咬引起的過敏性疾病的診斷，并具有抑制血小板凝集可用于抗血栓藥物。

本發(fā)明的白紋伊蚊的Apyrase編碼基因及其蛋白制備方法具有如下特點：

1)本發(fā)明的重組白紋伊蚊的成熟Apyrase具有與天然白紋伊蚊Apyrase相同免疫活性，可以引起人體過敏反應(yīng)，還具有血小板凝集抑制的活性；

2)本發(fā)明的重組的白紋伊蚊Apyrase蛋白不僅產(chǎn)量高，生產(chǎn)條件恒定，有利于進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，更適合進(jìn)行大量生產(chǎn)用于臨床診斷與治療；