[發(fā)明專利]耐酸中溫α-淀粉酶及其制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110182244.2
• 申請(qǐng)日: 2011-07-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102260694A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-11-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王青艷;朱婧;黃日波;申乃坤;秦艷;謝能中;王成華;廖思明;黎貞崇;陳東
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N15/56
• 分類號(hào): C12N15/56;C12N15/75;C12N9/28
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及耐酸中溫α-淀粉酶及其制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

α-淀粉酶(α-1，4-glucanhydrolase?EC3.2.1.1)，又稱為液化型淀粉酶。它能從淀粉分子的內(nèi)部任意切開(kāi)α-1，4糖苷鍵，產(chǎn)生分子量較小的麥芽糊精、葡萄糖及其它低聚糖。淀粉在α-淀粉酶的作用下，分子迅速降解，粘度下降，即完成液化作用。在淀粉糖加工業(yè)、紡織工業(yè)、造紙工業(yè)、制藥行業(yè)、釀酒行業(yè)及燃料乙醇生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用，具有相當(dāng)大的商業(yè)價(jià)值。目前在工業(yè)生產(chǎn)中，α-淀粉酶一般以微生物發(fā)酵法進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，這些微生物包括枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌或嗜熱脂肪芽孢桿菌等。

近年來(lái)隨著淀粉原料深加工工業(yè)的發(fā)展，酒精行業(yè)工藝條件的改變，要求酶制劑工業(yè)不斷更新和完善酶的種類，以滿足工業(yè)生產(chǎn)的要求。對(duì)于淀粉糖化工業(yè)，一般是采用雙酶法進(jìn)行液化、糖化，即先加α-淀粉酶液化，再加糖化酶來(lái)糖化產(chǎn)生葡萄糖。目前市售的淀粉酶最適pH為6.0-7.0，糖化酶的最適pH為4.5左右，兩者的作用pH值差異較大，而淀粉原料液的天然pH為4.5-5.0左右。傳統(tǒng)工藝淀粉液化后需添加酸來(lái)降低pH值后糖化酶才起作用，這樣用酸堿反復(fù)調(diào)節(jié)原料液的pH，既增加工藝，又引入外源離子，加重了分離的負(fù)擔(dān)。在酒精行業(yè)中，由于廢水的回填，使得原料液的pH值降為4-5，也不適合α-淀粉酶的作用。而在我國(guó)傳統(tǒng)白酒生產(chǎn)中，由于固態(tài)發(fā)酵不徹底，在酒糟中普遍含有10％以上的淀粉，但酒糟的pH很低，此酸性條件下的淀粉利用就需要開(kāi)發(fā)適合該生產(chǎn)條件的酸性α-淀粉酶。此外，以淀粉質(zhì)為原料的酒精發(fā)酵工業(yè)中，淀粉中低溫液化工藝(75-85℃噴射中溫α-淀粉酶液化1-2小時(shí)，然后降溫至60℃左右部分糖化后同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)酒精)與傳統(tǒng)的高溫液化糖化(高溫105℃噴射液化，95℃液化1-2小時(shí)，然后降溫至60℃左右部分糖化后發(fā)酵)的工藝相比，具有節(jié)能省耗、可發(fā)酵性糖損失少的優(yōu)點(diǎn)。由于耐酸性的α-淀粉酶能在酸性條件下保持高活性，不僅可以簡(jiǎn)化釀酒發(fā)酵工業(yè)的液化、糖化過(guò)程，降低淀粉深加工的生產(chǎn)成本，而且在消化類藥物、酒精糟液利用、一步法生產(chǎn)糖漿等諸多方面顯示出巨大的利用前景。

隨著我國(guó)淀粉糖、釀造及發(fā)酵工業(yè)的日益發(fā)展，對(duì)耐酸性淀粉水解酶的需求也將越來(lái)越大。為了適應(yīng)整個(gè)淀粉糖化、食品、紡織、制藥及酒精行業(yè)的需要，簡(jiǎn)化工藝，降低成本、省水節(jié)能，滿足一些在酸性條件下進(jìn)行淀粉原料液化工藝的要求，開(kāi)發(fā)一種耐酸中溫的α-淀粉酶就勢(shì)在必行。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述情況，本發(fā)明解決了現(xiàn)有α-淀粉酶耐酸性和溫度適應(yīng)性不能同時(shí)兼顧，以致應(yīng)用受到限制的問(wèn)題；采用重組DNA技術(shù)，提供了定點(diǎn)突變前體α-淀粉酶以改善其特性，得到了活力提高的耐酸耐溫α-淀粉酶突變體及其制備方法。

本發(fā)明從枯草芽孢桿菌[中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC?10028)]中克隆前體α-淀粉酶基因，對(duì)其141及558位點(diǎn)的氨基酸殘基進(jìn)行突變，并在芽孢桿菌中高效表達(dá)α-淀粉酶突變體。從而為耐酸性α-淀粉酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供一條可行途徑。本發(fā)明將分離到的編碼前體α-淀粉酶的基因的141及558位點(diǎn)的氨基酸殘基進(jìn)行突變，以改變其酸穩(wěn)定性和酶活力。并構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌宿主，高效表達(dá)了突變體α-淀粉酶，突變酶具有良好的酸穩(wěn)定性，有較寬的pH適用范圍，更適于工業(yè)化應(yīng)用。

α-淀粉酶突變體，是突變?chǔ)?淀粉酶編碼DNA序列的表達(dá)產(chǎn)物。α-淀粉酶突變體具有的氨基酸序列是通過(guò)對(duì)SEQ?ID?NO：12所示的前體α-淀粉酶氨基酸序列中R141及L558的氨基酸位點(diǎn)的替換而得到的。α-淀粉酶突變體的序列是在前體α-淀粉酶原有序列上發(fā)生了氨基酸替換。本發(fā)明涉及了兩對(duì)完全互補(bǔ)的引物，用重組PCR方法將前體α-淀粉酶的141及558位的氨基酸進(jìn)行突變(圖1)，得到經(jīng)過(guò)耐酸性改造的本發(fā)明突變體基因。編碼α-淀粉酶突變體的基因序列見(jiàn)SEQ?ID?NO：2。本發(fā)明的α-淀粉酶突變體pH低于5.0時(shí)具有酸穩(wěn)定性，且其活力提高為前體α-淀粉酶的3.5倍。

本發(fā)明所用的前體α-淀粉酶來(lái)源是枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌。