[發明專利]發根農桿菌介導的花生根誘導體系的建立方法及其應用

有效

• 申請號: 201110180112.6
• 申請日: 2011-06-29
• 公開（公告）號: CN102260707A
• 公開（公告）日: 2011-11-30
• 發明（設計）人: 耿麗麗;束長龍;張杰;宋福平;黃大昉
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/06;A01H5/00
• 代理公司: 北京兆君聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 11333
• 代理人: 胡敬紅

1.發根農桿菌介導的花生根誘導體系的建立方法，包括如下步驟：

(1)活化菌種，將發根農桿菌在含有鏈霉素、利福平的LB固體培養基上劃線培養，長出單菌落，挑取單菌落在含有鏈霉素、利福平的LB液體培養基中220rpm，30℃培養至OD₆₀₀＝0.2-0.8，

(2)微量注射，取發根農桿菌對花生外植體上胚軸微量注射，接種量為1×10⁷-5×10⁷；

(3)接菌的外植體放置到含有乙酰丁香酮的共培養基上培養1-3天，乙酰丁香酮的含量為5μmol?l^-1-100μmol?l^-1；

(4)轉移到繼代培養基上，培養6-25天。

2.根據權利要求1所述的方法，所述共培養基為MS基礎培養基。

3.根據權利要求3所述的方法，所述取指數期的發根農桿菌，接種量為每個外植體5×10⁷個細胞，共培養2天，共培養培養基中乙酰丁香酮的濃度為50μmol?l^-1。

4.根據權利要求1所述的方法，所述繼代培養基為MS基礎培養基。

5.根據權利要求1所述的方法，所述微量注射為采用微量注射器，分三點在上胚軸注射。

6.根據權利要求1所述的方法，所述花生外植體為完整胚的子葉放置在基本培養基上，光照培養5天左右后的小苗，切去下胚軸得到。

7.根據權利要求1所述的方法，所述發根農桿菌的菌株為發根農桿菌K599。

8.權利要求1-7任一所述的方法的應用，其特征在于所述發根農桿菌中含有外源基因載體，菌種活化時的培養基中還含有載體所帶的相應抗生素。

9.根據權利要求8所述的應用，所述外源基因載體中的基因為經密碼子優化的cry8Ea1或cry8Ha1，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO?1或SEQ?ID?NO2所示。

10.根據權利要求9所述的應用，所述外源基因載體中基因的上游添加了Ω序列、Kozak序列，下游添加了內質網定位信號，其核苷酸序列如SEQ?IDNO3或SEQ?IDNO4所示；骨架載體為插入了兩個MAR序列的基礎載體pCAMBIA2300，其結構如圖10所示；cry8Ea1或cry8Ha1基因由組成型啟動子35S驅動。