[發明專利]一種霍山石斛體細胞胚發生的方法

有效

• 申請號: 201110179435.3
• 申請日: 2011-06-30
• 公開（公告）號: CN102246697A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發明（設計）人: 朱慧秋
• 申請（專利權）人: 蕪湖華信生物藥業股份有限公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 合肥金安專利事務所 34114
• 代理人: 金惠貞

技術領域

本發明屬于植物組織培養技術領域，具體涉及一種霍山石斛體細胞胚發生的方法。

背景技術

霍山石斛（Dendrobium?huoshanense?C.?Z.?Tang?et?S.?J.?Cheng），又名霍石斛、霍斛、米斛，隸屬蘭科石斛屬，具有益精強陰、生津止渴、補虛贏、除胃中虛火之功效，被歷代本草推崇為石斛中的上品，深受現代人們的青睞。但是，霍山石解的生長對環境要求極其嚴格，加之歷代藥農的采集及近代生態環境的改變，野生霍山石解資源瀕臨滅絕，現在只有極少量被移栽在霍山縣長沖藥材場。霍山石斛雖然開花多，但結果少，而且霍山石斛的種子胚未分化、無胚乳，導致萌發率極低。無法滿足規模化人工栽培的需求。植物組織培養技術中的體細胞胚發生技術，能夠提供繁殖數量大、繁殖速度快、后代遺傳性狀穩定的體細胞胚。體細胞胚具有和植株同樣的物質代謝和形態發育潛能，可用來代替原藥材生產相關的活性物質。因此，體細胞胚發生技術受到了廣泛關注。霍山石斛體細胞胚的發生技術為霍山石斛藥用價值的持續利用和種質資源的有效保護提供了一種重要手段。

石斛體細胞胚的發生是間接方式，即體細胞胚是從愈傷組織發育而成的，當前，該發生方式存在以下不足：（1）胚性愈傷組織的誘導需要添加外源激素，外源激素將通過體細胞胚富集到完整植株中，克隆植株中殘留的外源激素對人體健康潛伏著嚴重的危害；（2）體細胞胚發育階段不一致、同步性很小（低于50%）、大小差異較大、再生植株的存活率很低（小于10%）。因此，難以滿足霍山石斛體細胞胚的規自動化生產及大面積人工栽培種苗的需要。本專利通過控制培養基的氧化還原電位以誘導產生胚性愈傷組織，胚性愈傷組織在控制一定濕度的環境中發生為霍山石斛體細胞，通過過篩法、饑餓法或后期液體培養法獲得大量同步化的霍山石斛體細胞胚，這方面的技術目前尚未見報道。

發明內容

霍山石斛是一種傳統而名貴的保健藥材，其野生資源瀕臨滅絕。為了解決現有霍山石斛體細胞胚發生技術中存在的愈傷組織的誘導需要外源激素，體細胞胚發育階段不一致、同步性很小、大小差異較大導致再生植株的存活率很低等問題，本發明提供的一種霍山石斛體細胞胚發生的方法。

實現上述目的的技術解決方案如下：

一種霍山石斛體細胞胚發生的方法包括以下操作步驟：

（1）無菌試管苗的誘導

取霍山石斛成熟果實，先用質量分數為1%的次氯酸鈉水溶液進行表面消毒60?min，再用無菌雙蒸餾水沖洗3～5次，然后切開果實，取出種子，并將種子撒在固體MS培養基上，于溫度22±2℃、光照強度2000～3000勒克斯、每天光照12小時的條件下培養6～7個月，獲得4-6?cm長的霍山石斛無菌試管苗；

（2）胚性愈傷組織的誘導

取無菌試管苗的帶節的莖段的形態學下端，插入氧化還原電位為-0.03～-0.02伏的固體透導培養基中，于溫度22±2℃、黑暗中誘導培養20～25天，得胚性愈傷組織；

（3）體細胞胚的誘導

將胚性愈傷組織轉移到固體MS培養基中，在相對濕度為70～85%、溫度22±2℃、光照強度2000～3000勒克斯、每天光照12小時的條件下誘導培養3周后，轉接到固體MS培養基中，在相對濕度為70～85%、溫度22±2℃、光照強度2000～3000勒克斯、每天光照12小時的條件下誘導培養3周；按本步驟的誘導操作條件連續轉接10～15次，轉接培養基為固體MS培養基，得體細胞胚；

（4）體細胞胚的同步化增殖

將體細胞胚轉移到液體MS培養基或固體MS培養基中，在溫度22±2℃、光照強度2000～3000勒克斯、每天光照12小時的條件下，采用過篩法或饑餓法同步化增殖培養，得霍山石斛體細胞胚。

所述固體透導培養基是在固體MS培養基的基礎上加入質量分數為50～100?mg/L的磷酸鈉。

所述過篩法按如下步驟操作：將液體培養25天的體細胞胚先通過10目篩，收集透過的體細胞胚繼續培養5天后再通過20目篩，收集截留的體細胞胚；所述饑餓法按如下步驟操作：將體細胞胚在新鮮MS培養基中培養25天后，用無菌的10目篩過濾，透過的體細胞胚再用20目篩過濾，將截留的體細胞胚轉移到無鐵鹽的MS培養中饑餓培養2天后，轉入新鮮的MS培養基中繼續培養5天。

與現有技術相比，本發明的方法具有如下優點：