[發明專利]春石斛蘭多倍體復合體的人工培育及種苗工廠化生產方法

有效

• 申請號: 201110177879.3
• 申請日: 2011-06-29
• 公開（公告）號: CN102239806A
• 公開（公告）日: 2011-11-16
• 發明（設計）人: 李秀蘭;陳力;陳瑞陽
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及蘭花人工培育方法及其種苗工廠化生產技術，特別是一種春石斛蘭(Dendrobium?Nobile)人工多倍體復合體的培育及種苗工廠化生產方法。

背景技術

石斛蘭(Dendrobium)，是世界四大觀賞洋蘭之一。目前國際上已培育出大量石斛蘭觀賞品種，2010年在東京召開的世界蘭花大會上，一株開了2000多朵花的石斛蘭獲得金獎，石斛蘭新品種培育已成為世界花卉育種的新熱點。然而，迄今為止，世界石斛蘭花新品種的培育多采用品種間雜交獲得。例如CN200710160571.1和CN200710160572.6公開了一種春石斛組織培養快繁方法和工廠化栽培方法。這些方法存在品種間雜交變異范圍窄，新品種選育頻率低的問題。

發明內容

本發明的目的是提供一種春石斛蘭人工多倍體復合體的培育及種苗工廠化生產方法，可以克服一般品種間雜交變異范圍窄，新品種選育頻率低的缺陷。它是通過“基因組多倍化與雜交相結合”的方法。首先，將普通二倍體春石斛蘭人工誘變成同源四倍體春石斛，然后，與二倍體春石蘭雜交，創造出三倍體春石斛蘭新種質，在此基礎上，再將三倍體春石斛蘭人工誘變成六倍體春石斛蘭。三倍體、六倍體春石斛蘭都是迄今為止在自然界不存在的品種，是人工創造的新物種，具有極強的生命力和應用價值。本發明同時還建立了通過春石斛蘭種子類原球莖(PLBs)進行春石斛蘭多倍體復合體種苗工廠化生產技術，種苗生產可達100萬株/年以上，為春石斛蘭新品種推廣奠定了基礎。

本發明提供的一種春石斛蘭花人工多倍體復合體的培育及其種苗工廠化生產方法包括以下步驟：

在普通二倍體春石斛蘭開花期進行人工授粉，取收獲的蒴果，將種子接種在1/2MS液體培養基中進行非共生萌發培養，將原胚期種子原球莖移入含有0.01％秋水仙堿的1/2MS液體培養基中進行誘變培養，后轉入1/2MS固體培養基光照培養，直至春石斛蘭成苗，選取染色體數目2n＝76的四倍體幼苗進行開花培養，開花后，以四倍體為母本，二倍體為父本(4x♀×2x♂)或以二倍體為母本，四倍體為父本(2x♀×4x♂)雜交，獲得三倍體春石斛蘭。三倍體春石斛蘭雜交種子形成早期(原胚期)再移入含有0.01％秋水仙堿的1/2MS液體培養基中進行六倍體人工誘變處理，處理150-180h后，轉入1/2MS固體培養基光照培養，直至春石斛蘭成苗，選取染色體數目2n＝114的幼苗，為加倍成功的六倍體春石斛蘭。然后進行瓶苗移栽。按常規的春石斛蘭栽培管理，直至開花。

本發明提供的一種春石斛蘭花人工多倍體復合體的培育及其種苗工廠化生產方法包括以下步驟：

1、四倍體春石斛蘭培育方法步驟如下：

1)二倍體春石斛蘭的開花與人工授粉：按常規方法進行春石斛蘭的栽培管理，每年春天4-5月份，在春石斛蘭開花后一周內，進行自花或同株異花人工授粉，授粉后的春石斛蘭要精心管理，放在通風、半透光，室溫20-25℃，濕度30-50％條件下，防止落花落果，收獲成功授粉后，生長4-5個月后的蒴果。

2)春石斛蘭種子非共生萌發培養：取上述授粉后4-5個月得到的蒴果，在超凈臺內用75％酒精消毒1分鐘，再用0.1％升汞消毒10分鐘，無菌蒸餾水沖洗5遍，用無菌解剖刀沿蒴果縱軸方向切開，將春石斛蘭種子接種在1/2MS液體培養基中，間歇振蕩，進行種子非共生萌發培養20-60天。至種子類原球莖(PLBs)發育成球形。

3)四倍體春石斛蘭的人工誘變：將發育成球形的種子原球莖(原胚期)移入含有0.01％秋水仙堿的1/2MS液體培養基中進行誘變處理，處理150-180小時后轉入1/2MS固體培養基上繼續培養，室溫25℃，培養30-60天：在光周期14小時/天，光強度3000Lux，直至春石斛蘭成苗移栽。

4)四倍體春石斛蘭染色體鑒定：在瓶苗移栽時，按株編號，取新生長的根尖，放入對二氯代苯飽和水溶液中前處理4小時，后將根尖轉入體積比為3∶1的甲醇與冰醋酸固定液中固定4小時以上，4℃冰箱中保存備用。用卡寶品紅染色液染色，壓片法制備染色體標本，400倍以上顯微鏡觀染色體數目，選取染色體數目2n＝76的幼苗，為加倍成功的四倍體春石斛蘭，其他染色體數目的幼苗，不能使用。

5)四倍體春石斛蘭的栽培管理：四倍體春石斛蘭除植株健壯，葉片加厚，花大，抗病性提高外，其他與二倍體春石斛蘭基本相同，栽培管理條件也相同。