[發明專利]同時檢測人EBV、BKV和 CMV的三重實時熒光定量PCR方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201110177104.6
• 申請日: 2011-06-28
• 公開（公告）號: CN102363818A
• 公開（公告）日: 2012-02-29
• 發明（設計）人: 李全;焦守恕
• 申請（專利權）人: 同昕生物技術（北京）有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

技術領域

本發明涉及醫學分子生物檢測技術。特別是一種可同時檢測人EBV、BKV和CMV的三 重實時熒光定量PCR方法及試劑盒。可應用于移植后病人或其他免疫抑制狀態下病人血清或 其他樣品中三種病毒載量的同時監測。

技術背景

器官移植是現代醫學的標志性學科之一。自1959年首例腎移植成功以來目前世界上已有 70多萬尿毒癥患者接受了器官移植而獲得新生，而且這個數字還在以每年近5萬的速度增加。 截至2003年，我國累計完成腎臟移植5萬多例，現在每年完成超過5000例，數量僅次于美 國位居世界第二位。中國約有100多萬尿毒癥患者，每年還有近12萬的新增病人。對這些患 者，腎臟移植是目前最重要的治療手段。然而移植腎臟的長期存活，始終是腎移植成功與否 的主要問題。

感染是器官移植手術后重要的并發癥之一，也是造成器官移植失敗的重要原因。在移植 早期，感染造成的死亡率達40％-78％。隨著新的免疫抑制藥物的出現及其聯合應用，使單一 藥物用量有所下降，從而使感染引起的移植早期死亡率顯著下降。盡管如此，在導致器官移 植受者死亡的原因中，感染仍居首位，其中病毒感染占很大的比例。移植后病毒感染早期可 能沒有明顯的臨床表現，對移植腎的損傷也不易被發現，感染后期卻會影響移植腎的功能。 同時，不同的病毒感染，往往需要不同的治療方案才能奏效，因此，盡早診斷和預防病毒感 染，同時進行病毒載量與感染情況的不斷監測，對降低腎移植后病毒感染的危害有很大的臨 床意義。

巨細胞病毒(Cytomegalovirus?CMV)，EB病毒，Epstein-Barr?virus(EBV)以及BK病毒BK (polyomavirus?BKV)是實體器官移植后最常見的病毒感染。即使在無癥狀的感染情況下，也 會對移植器官造成影響。目前已經有多種檢測方法用于病毒滴度或載量的檢測。最常用的為 免疫學方法和定量PCR方法。然而這些方法都只能同時檢測一種病毒感染情況，病人要想了 解這三種病毒的感染情況，至少得做三個檢測。最近有前瞻性研究表明，這三種病毒存在共 感染的情況，如果能有一種同時檢測這三種病毒載量的方法，將會使檢測過程變得方便、快 速。

實時熒光定量PCR技術(Real-time?quantitative?Polymerase?Chain?Reaction，Real?Time? PCR)以其快速、靈敏、特異、重復性好等特點前最常用病毒基因載量檢測方法之一，廣泛 的應用在各種病毒上。特別是Taqman探針技術，應用更加廣泛。在移植相關病毒檢測領域 目前已經有成熟的CMV，BKV，EBV病毒Taqman探針定量PCR檢測試劑盒，均能夠準確 迅速的檢測病毒的載量。然而如前所述，這些檢測試劑盒均只能檢測一個靶標。

多重熒光定量PCR技術是在熒光定量PCR基礎上發展起來的一個新技術，它強調在同 一個反應體系里同時擴增多個靶標。最近已有多項研究將多重定量PCR技術應用于病毒診斷 檢測領域。在移植后病毒檢測方面，Kaoru?Wada等用多重定量PCR技術，同時檢測27例造 血干細胞病人和19例肝移植病人全血樣品中的HHV-6病毒，CMV以及EBV病毒共計303 份樣品，結果顯示多重PCR體系與單一擴增結果在靈敏度和特異性方面基本相同。Yasuhito Funahashi等用多重定量PCR技術同時檢測BKV病毒、JCV病毒以及腺病毒，同樣取得良好 結果。這些結果都說明了多重PCR技術用于病毒檢測可靠性。但是到目前為止，尚無報道有 同時檢測CMV病毒，EBV病毒以及BKV病毒的試劑盒。

發明內容

本發明的目的在于提供一種能同時檢測CMV病毒，EBV病毒以及BKV病毒的多重定量 Taqman?PCR方法，同時基于該方法提供相應的試劑盒。該試劑盒可用于人全血或尿液標本的 檢測。

一種同時檢測人EBV、BKV和CMV的三重實時熒光定量PCR方法，其特征在于，所 述實時熒光定量PCR的反應體系中同時采用以下三套引物及探針：

CMV-FP：ATC?AAC?ATA?AGG?ACT?TTT?CAC?ACT?TT，

CMV-RP：GAA?TAC?AGA?CAC?TTA?GAG?CTC?GGG?GT，

CMV-探針：CTG?GCC?AGC?ACG?TAT?CCC?AAC?AGC?A-BHQ1；

EBV-FP：GGA?ACC?TGG?TCA?TCC?TTT?GC，