[發明專利]一種抗人蛋白RN181的單克隆抗體及雜交瘤細胞株3952與試劑盒

有效

• 申請號: 201110177050.3
• 申請日: 2011-06-28
• 公開（公告）號: CN102268409A
• 公開（公告）日: 2011-12-07
• 發明（設計）人: 李明;王穗海;黃湘;李月;董慧敏
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/40;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛

技術領域

本發明涉及一種抗人蛋白RN181的單克隆抗體及其試劑盒。?

背景技術

????肝癌是世界上最常見的致命癌癥之一，在各種癌癥中發病率居第四，大部分患有肝癌的病人都在作出診斷后的一年之內死亡，并且在以往的20多年里死亡率都沒有下降。一部分原因是現有的診斷方法并不是很有效，肝癌的發現和診斷較為困難，尤其是原發性肝癌發現時多為晚期。因此對于原發性肝癌的早期檢測可有效的提高對這種疾病的預后。但是現有的肝癌血清標志物諸如甲胎蛋白AFP和DCP缺乏足夠的檢測特異性和靈敏性，因此需要選擇更加特異性的檢測靶點。?

人蛋白RN181是一種新發現的具有類似E3酶活性的蛋白，它能參與蛋白酶體途徑。它具有RING指結構域，屬于C3HC4型鋅指蛋白家族的蛋白。其基因全長716個堿基，編碼蛋白長153個氨基酸。RING指區域是一種蛋白質相互作用的區域，既往研究提示擁有RING指的蛋白普遍具有兩方面功能：①可參與基因轉錄調控、DNA修復和重組、細胞轉化及腫瘤抑制等多種生物過程；②RING指區域是E₃泛素蛋白連接酶的重要活性區域,許多含有RING指結構域的蛋白都在泛素化途徑中起關鍵作用。我們的研究發現人RN181蛋白在原發性肝癌細胞內會表達下降。RN181免疫組化檢測結果顯示，所有外科手術時切除的原發性肝癌腫瘤樣本中均呈弱陽性或不表達，而相對應的癌旁正常細胞或正常肝臟中則表達強烈。根據檢測到的陽性肝細胞著色程度，可將RN181的著色歸入四個不同的等級（Score0、Score1、Score2、Score3）中。Score0顯示原發性肝癌惡化的一種高度特異性狀況，呈零級著色；對應于癌旁或正常肝樣本中三級著色。?

????因此，抗RN181單克隆抗體將有利于原發性肝癌的診斷，并使原發性肝癌的診斷獨立于病因學之外，因而更為簡便。而其他一些腫瘤標志物諸如KI-67、P53、PCNA的特異性和靈敏性均不理想，僅用于識別肝臟組織中的增殖細胞，相比之下，抗RN181單克隆抗體的應用將提高原發性肝癌檢測的靈敏度和特異性。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種抗人蛋白RN181的單克隆抗體，它具有區分原發性肝癌組織和正常組織，以及對原發性肝癌組織的作用。?

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：?

一種雜交瘤細胞株，其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC3952。保藏日期為2010年6月25日；分類命名為鋅指蛋白RN181單克隆抗體雜交瘤細胞株。

一種抗人蛋白RN181的單克隆抗體，由上述雜交瘤細胞株分泌所得。優選的實施方案，抗人蛋白RN181的單克隆抗體是由上述雜交瘤細胞株通過接種小鼠腹腔，抽腹水的方法進行制備。?

作為優選，純化抗人蛋白RN181的單克隆抗體是使用protein-G和分子篩的方法，純化后的單克隆抗體純度不低于85%。?

作為優選，抗人蛋白RN181的單克隆抗體的鑒定方法是SDS-PAGE結合灰度掃描的方法。?

作為優選，抗人蛋白RN181的單克隆抗體區分原發性肝癌組織和癌旁組織是通過免疫組化方法來實現的。?

作為優選，抗人蛋白RN181的單克隆抗體對原發性肝癌組織進行分級是通過免疫組化方法來實現的。?

本發明的另一個目的是利用抗人蛋白RN181的單克隆抗體制備一種原發性肝癌免疫組化診斷試劑盒。?

一種原發性肝癌免疫組化診斷試劑盒，包括3%H₂O₂、抗人蛋白RN181的單克隆抗體、生物素標記的羊抗鼠IgG抗體、鏈霉素標記的辣根過氧化物酶及DAB顯色緩沖液，所述抗人蛋白RN181的單克隆抗體為上述保藏編號為CGMCC3952的雜交瘤細胞株分泌的抗體，工作濃度為2μg/ml。?

根據本發明目的一個優選的實施方案，使用原發性肝癌免疫組化診斷試劑盒檢測時，需自配0.01M?PBS（pH7.4），及使用蘇木素，蘇木素采用市售產品，推薦北京中杉金橋公司的產品。?

作為優選，原發性肝癌免疫組化診斷試劑盒所使用的標本為肝臟組織石蠟切片。?

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根據本發明目的一個優選的實施方案，其中擴增RN181基因的引物序列為：上游引物：5'-CTC?GAG?ATG?GCG?TCC?TAT?TTC?3'，下游引物：5'-GGA?TCC?CGT?GTA?CAT?GGC?3’。

與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：?