[發(fā)明專利]神經(jīng)干細胞培養(yǎng)擴增方法及所用培養(yǎng)基

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110173821.1
• 申請日: 2011-06-23
• 公開（公告）號: CN102839154A
• 公開（公告）日: 2012-12-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 金宜強;劉軍;楊立敏
• 申請（專利權(quán)）人: 上海安集協(xié)康生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N5/0797
• 分類號: C12N5/0797
• 代理公司: 北京永新同創(chuàng)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11376
• 代理人: 程大軍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)擴增領(lǐng)域。本發(fā)明特別涉及用于神經(jīng)干細胞培養(yǎng)擴增的培養(yǎng)基以及使用所述培養(yǎng)基培養(yǎng)擴增神經(jīng)干細胞的方法。

背景技術(shù)

神經(jīng)干細胞(Neural?Stem?Cell，NSC)是存在于胚胎和成體腦、脊髓等神經(jīng)組織中的一種干細胞，是一類具有分裂潛能和自更新能力的母細胞，可通過不對等的分裂方式分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞等神經(jīng)組織的各類細胞，也可轉(zhuǎn)分化成血細胞和骨骼肌細胞。在腦、脊髓等所有神經(jīng)組織中，不同的神經(jīng)干細胞類型產(chǎn)生的子代細胞種類不同，分布也不同。目前的科學技術(shù)已經(jīng)可以在體外培養(yǎng)擴增神經(jīng)干細胞，用于生命科學研究、藥物篩選測試、臨床應用研究等領(lǐng)域。

神經(jīng)干細胞通常的分離提取方法是，采用化學或機械方法將胚胎或成體的腦、脊髓等神經(jīng)組織分散成單細胞后，或者對培養(yǎng)的干細胞進行定向誘導分化后，對獲得的細胞混合液初步培養(yǎng)一段時間，由于神經(jīng)干細胞具有形成神經(jīng)球的特性，可以通過挑選神經(jīng)球的方法從中分離獲得少量神經(jīng)干細胞。

神經(jīng)干細胞通常的培養(yǎng)擴增方法是，將用前段所述方法獲得的神經(jīng)球作為初始種子，接種入含血清或不含血清的培養(yǎng)液，置于5％CO₂、37℃條件下培養(yǎng)，每培養(yǎng)到一定程度就挑選合適的神經(jīng)球進行消化傳代，實現(xiàn)細胞數(shù)量擴增，以滿足研究或測試需求的數(shù)量和質(zhì)量。(《人胚神經(jīng)干細胞的分離培養(yǎng)和鑒定》，羅樹偉，謝常青，盧光，中南大學學報(醫(yī)學版)，2004，29(2)：129-131；《早期人胚神經(jīng)干細胞分布及分離培養(yǎng)》，呂海俠，翟偉，劉勇等，西安交通大學學報(醫(yī)學版)，2003年4月第24卷第2期：97-100；《胎鼠脊髓源性神經(jīng)干細胞分離培養(yǎng)與鑒定》，李勇，敬曉棋，竇忠英，中國生物工程雜志，2005，25(6)：25-30；《誘導人臍血神經(jīng)干細胞向神經(jīng)細胞分化的研究》，季旭東，高超，楊月景，河南醫(yī)學研究，2005年9月第14卷第3期：215-219；《異體和自體骨髓源神經(jīng)干細胞周圍神經(jīng)移植實驗研究》，李貴濤，徐如祥，姜曉丹等，中國矯形外科雜志，2007年7月第13卷第14期，1087-1089；《人和小鼠神經(jīng)干細胞的體外培養(yǎng)的分化研究》，吳益民，喻紅，林麗珠等，復旦學報(自然科學版)，2002年2月第41卷第1期，57-62)。

由于血清具有成分復雜、質(zhì)量不穩(wěn)定、價格昂貴等缺點，雖然有血清時培養(yǎng)擴增效率較高，然而無血清培養(yǎng)仍然成為發(fā)展趨勢，目前一般采用添加了生長因子、抗生素等成分的DMEM或者DMEM/F12培養(yǎng)液作為神經(jīng)干細胞的無血清培養(yǎng)液(《體外血清預培養(yǎng)促進神經(jīng)干細胞增殖》，萬虹，歷俊華，張紹東，中國臨床康復，2006，10(45))。

神經(jīng)干細胞有靜態(tài)培養(yǎng)和動態(tài)培養(yǎng)兩種方式，前者是用細胞培養(yǎng)瓶放在溫箱中靜態(tài)條件下培養(yǎng)，在無血清條件下擴增效率較低(《哺乳動物神經(jīng)干細胞擴增技術(shù)研究進展》，董良，齊瀚實，生物技術(shù)，2005，15(4))；后者是利用細胞培養(yǎng)生物反應器在旋轉(zhuǎn)等動態(tài)條件下培養(yǎng)，擴增效率較高，然而生物反應器價格昂貴，并且部分情況下為了實驗的方便或由于實驗條件的要求，神經(jīng)干細胞不適合用生物反應器進行培養(yǎng)擴增。

此外，目前神經(jīng)干細胞培養(yǎng)還需要添加抗生素，有可能對神經(jīng)干細胞的進一步應用造成影響。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種新的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)擴增方法，其對神經(jīng)球的挑選、培養(yǎng)液的配方和換液時機等接種培養(yǎng)工藝進行了改進，實現(xiàn)了在靜態(tài)培養(yǎng)條件下神經(jīng)干細胞10-15天的擴增效率達到7-14倍，并且本發(fā)明所述方法不需要添加抗生素，更好的滿足科研和工業(yè)化生產(chǎn)的需要。

在一個方面，本發(fā)明提供了一種神經(jīng)干細胞培養(yǎng)擴增方法，所述方法包括：

(a)將神經(jīng)干細胞接種在包含堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和表皮生長因子(EGF)的DMEM/F12或DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)；

(b)2、3或4天后在培養(yǎng)基中添加5-20％體積的營養(yǎng)補充液并繼續(xù)培養(yǎng)，其中所述營養(yǎng)補充液是包含1×B27添加劑，1×N2添加劑，1.0-3.0mM的L-谷氨酰胺，0.5-1.5mM的丙酮酸鈉，0.5-1.5mM的N乙酰半胱氨酸(NAC)，50-150ng/ml的bFGF，50-150ng/ml的EGF以及1-15ng/ml的白血病抑制因子(LIF)的DMEM/F12或DMEM培養(yǎng)基；

(c)監(jiān)測培養(yǎng)基中形成的神經(jīng)球直徑，當60％以上、優(yōu)選70％以上神經(jīng)球直徑高于閾值時，分離直徑高于所述閾值的神經(jīng)球，消化后收獲，其中所述閾值為200-500μm，例如為250μm、300μm、350μm、400μm或450μm；