[發明專利]一種狂犬病病毒的RT-LAMP檢測試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 201110173234.2
• 申請日: 2011-06-25
• 公開（公告）號: CN102230031A
• 公開（公告）日: 2011-11-02
• 發明（設計）人: 向華;黃元;陳晶;徐敏;向蓉
• 申請（專利權）人: 廣東省農業科學院獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 譚英強

1.一種狂犬病病毒的RT-LAMP檢測試劑盒，包括反應液A、引物液B、引物液C和顯色液D，其特征在于：

（1）反應液A包含：10×恒溫反應緩沖液、AMV（8U/μl）、RNase抑制劑（40?U/μl）、DNA聚合酶（8?U/μl），10mmM?dNTP、100mM氯化鎂、5M甜菜堿，

其中10×恒溫反應緩沖液含有200mM三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽（pH8.8）、100mM氯化鉀、100mM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1%曲拉通X-100；

反應液A每管19μl的組成為：2.5μl?10×恒溫反應緩沖液、1.0μl?AMV（8U/μl）、0.25μl?Rnasin（40?U/μl）、1.0μl?DNA聚合酶（8?U/μl）、1.5μl?10mmM?dNTP、1.5μl?100mM氯化鎂、5.0μl?5M甜菜堿和5.25μl?DEPC處理水；

（2）引物液B包含：20μM引物LF3,?20μM引物LB3,?10μM引物LFIP、10μM引物LBIP，其中，

引物LF3序列為：5’-?GCAGCTAGAACCATGACTGG（SEQ?ID?NO：1），

引物LB3序列為：5’-?GTTGCCACTGAACCACT（SEQ?ID?NO：2），

引物LFIP序列為：

5’-?CTGCAACCTGTTGAGCAGAGCACAGCCCCAACAAGAAAGTGT（SEQ?ID?NO：3），

引物LBIP序列為：

5’-?CTCGGAGCTTGACATAAGGGCCCTCAAGCCCGAGATCAAAGG（SEQ?ID?NO：4）；

（3）引物液C包含：20μM引物NF3、20μM引物NB3、10μM引物NFIP、10μM引物NBIP，其中，

引物NF3序列為：5’-TGCAGTTTTTTGAGGGGACA?（SEQ?ID?NO：5），

引物NB3序列為：5’-TTGCCCGGATATTTTGCTCA?（SEQ?ID?NO：6），

引物NFIP序列為：

5’-CCACCAGAGAACCTGGGGTGATTGAAGACTGGACCAGCTATG?（SEQ?ID?NO：7），

引物NBIP序列為：

5’-AGGGAATTGGGCTCTGACAGGAAGACCGACTAAGGACGCAT（SEQ?ID?NO：8）；

（4）顯色液D為熒光染料SYBR?GREEN?I。

2.一種檢測狂犬病病毒的方法，包括如下步驟：

在裝有19μl反應液A的反應管1中加入4μl引物液B，再加入2μl待檢RNA；

在裝有19μl反應液A的反應管2中加入4μl引物液C，再加入2μl待檢RNA；

將反應管1和2于63℃恒溫水浴箱中放置90min；

在上述反應管中分別加入1μl?100倍稀釋的顯色液D，直接用肉眼觀察顏色變化，反應管1和反應管2任何一管顏色變為綠色，則說明樣品中含有狂犬病病毒，如顏色變為黃色，說明待檢樣品中不含有狂犬病病毒；

其中的反應液A、引物液B、引物液C、顯色液D均如權利要求1所述。