[發(fā)明專利]一種HK97噬菌體病毒樣顆粒的嵌合體及其用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110171730.4
• 申請日: 2011-06-24
• 公開（公告）號: CN102337251A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳霄;邱志華;楊仕俊;陳芬;廖玉華;周子華;王敏
• 申請（專利權(quán)）人: 華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院
• 主分類號: C12N7/04
• 分類號: C12N7/04;C12N7/02;C12N15/11;A61K48/00
• 代理公司: 武漢開元知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 42104
• 代理人: 王和平

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種HK97噬菌體病毒樣顆粒蛋白的嵌合體的構(gòu)建及其純化，以及在生物免疫靶向治療中的作用。?

發(fā)明背景?

針對慢性疾病的治療性疫苗是目前疫苗研究的熱點之一，這些疾病包括：慢性病毒感染、過敏性疾病、腫瘤、糖尿病、高血壓和阿爾茨海默病等。與普通預(yù)防性疫苗不同的是：治療性疫苗針對的是自身抗原或外來免疫耐受抗原，因此，治療性疫苗要發(fā)揮治療作用必須首先打破免疫耐受，產(chǎn)生針對特定抗原的自身抗體或自身反應(yīng)T細胞。由于治療性疫苗所針對的靶抗原一般是短肽，抗原性較弱，必須與合適的載體結(jié)合后，在免疫佐劑的幫助下才能發(fā)揮作用，因此，選擇合適的載體及佐劑往往是治療性疫苗成功的關(guān)鍵。?

目前常用的載體如KLH、破傷風(fēng)類毒素等，效力一般不強，必須使用佐劑，而常用的佐劑如弗氏佐劑雖然效能較強，但不能應(yīng)用于人體，鋁制佐劑雖然可應(yīng)用于人體，但免疫效能很弱，而且也存在如腦動脈硬化、鋁鹽局部堆積等不良反應(yīng)。因此，理想的治療性疫苗載體，應(yīng)該在與靶抗原結(jié)合后，在不應(yīng)用免疫佐劑的情況下，就能有效打破機體的免疫耐受，產(chǎn)生高滴度抗體，發(fā)揮治療作用。?

病毒樣顆粒就是這樣一類理想的疫苗載體。病毒樣顆粒(VLP)是由病毒衣殼蛋白裝配成的不含病毒核酸的空殼結(jié)構(gòu)，具有病毒的外形和免疫原性，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生以體液免疫為主的反應(yīng)，從而產(chǎn)生針對與之結(jié)合的抗體，由于不具有病毒的核酸成分，因此避免了病毒復(fù)制增殖的風(fēng)險。病毒樣顆粒由大量重復(fù)結(jié)構(gòu)的衣殼蛋白單體聚合而成，進入體內(nèi)后可以與特異性B細胞表面的B細胞受體結(jié)合并激活B細胞，同時，VLP還可提供外源性T細胞表位而激活輔助性T細胞，從而突破自身免疫耐受。另外每個衣殼蛋白單體一般具有堿性多肽域，如賴氨酸的-NH2，這些堿性多肽域朝向顆粒的外表面，短肽等小分子只要帶有合適的氨基酸基團，如-SH，通過異雙功能交聯(lián)劑就能結(jié)合并展示于VLPs表面，刺激機體產(chǎn)生抗體。?

目前國內(nèi)外已制備出多種噬菌體病毒樣顆粒，如Qβ噬菌體病毒樣顆粒、人乳頭瘤病毒樣顆粒(HPV)、MS₂病毒樣顆粒等。瑞士Cytos公司將Qβ噬菌體病毒樣顆粒為載體研制了一系列治療性疫苗，包括阿爾茨海默病AD疫苗(CAD106)、尼古丁疫苗(NIC002)、過敏性哮喘疫苗(CYT003-QbG10)等，其中其研制的針對血管緊張素II的降壓疫苗?(CYT006-AngQb)，已完成IIa期臨床實驗，針對過敏性鼻結(jié)膜炎研制的疫苗(CYT003-QbG10)已完成IIb期臨床實驗。而比利時葛蘭素史克公司(GSK)研制的已經(jīng)上市的子宮頸癌疫苗Cervarix(TM)的主要疫苗成分就是HPV-16和HPV-18。這些病毒樣顆粒顯示了強大的免疫原性和人使用之后的安全性。迄今為止，HK97噬菌體病毒樣顆粒的研究雖有文獻報道，但是對其嵌合體的研究少見，且作為生物免疫靶向治療載體的用途未見報道。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個目的是提供一種HK97噬菌體病毒樣顆粒的嵌合體。?

本發(fā)明的第二個目的是HK97噬菌體病毒樣顆粒的嵌合體在生物免疫靶向治療中的作用。?

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：?

HK97噬菌體病毒樣顆粒蛋白嵌合體HII-HK97-P的制備：?

(1)將編碼HK97噬菌體病毒樣顆粒頭端的蛋白GP4基因插入pETDuet-1質(zhì)粒(購自Novagen公司)的多克隆位點上；?

(2)在編碼HK97噬菌體病毒樣顆粒頭端的蛋白GP5基因的C端添加表達AFHYESQ短肽的堿基序列，將該GP5基因插入pETDuet-1質(zhì)粒的多克隆位點上，構(gòu)建嵌合體表達質(zhì)粒pETDuet-HK97-P；?

(3)將質(zhì)粒pETDuet-HK97-P轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細菌，IPTG誘導(dǎo)表達病毒樣顆粒嵌合體前體P?II-HK97-P；?

(4)6％PEG80004℃沉降病毒樣顆粒嵌合體前體PII-HK97-P；?

(5)強陰離子交換層析純化所述病毒樣顆粒嵌合體前體PII-HK97-P；?

(6)酸化誘導(dǎo)所述病毒樣顆粒嵌合體前體PII-HK97-P成熟膨脹為成熟病毒樣顆粒嵌合體HII-HK97-P；?

(7)凝膠層析純化成熟病毒樣顆粒嵌合體HII-HK97-P。?