[發明專利]番鴨小鵝瘟病乳膠凝集試劑及其制備方法

有效

• 申請號: 201110166777.1
• 申請日: 2011-06-17
• 公開（公告）號: CN102346191A
• 公開（公告）日: 2012-02-08
• 發明（設計）人: 陳少鶯;朱小麗;林鋒強;程曉霞;陳仕龍;王劭
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院畜牧獸醫研究所;陳少鶯
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;C07K16/08;C12N5/20;C12R1/91
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• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及番鴨小鵝瘟病乳膠凝集試劑。

背景技術

番鴨小鵝瘟病是由鵝細小病毒(Goose?parvovirus，GPV)引起一月齡以內雛番鴨的病毒性傳染病，該病1997年以來在福建省莆田、福清等地的番鴨飼養區暴發流行，目前全國各番鴨飼養區均有發生。臨床上發病雛番鴨以腹瀉、腸粘膜脫落形成栓塞為特征，發病率50％～70％、病死率40％～65％，給養鴨業造成一定的經濟損失。臨床上該病不僅常與番鴨細小病毒病(三周病)混合感染，且常被基層獸醫誤診為番鴨細小病毒病。由于抗小鵝瘟高免血清對該病具有較好的治療效果，因此快速診斷是有效控制該病減少損失的前提。然而，我國至今尚缺乏商品化的番鴨小鵝瘟病快速診斷試劑，給臨床診斷帶來很大困難。因此，快速確診該病的試劑不僅具有較好的應用價值和產業化前景，而且對有效控制該病是必不可少的。

發明內容

本發明的目的就是提供番鴨小鵝瘟病乳膠凝集試劑及其制備方法，它是通過如下技術方案來實現的：

取一種來源于人工篩選的抗番鴨源鵝細小病毒(Goose?parvovirus，GPV)雜交瘤細胞株D11株(即：抗GPV雜交瘤細胞株D11株)，應用抗GPV雜交瘤細胞株D11株制備抗番鴨源鵝細小病毒單克隆抗體(即：抗GPV單克隆抗體)，然后用抗GPV單克隆抗體標記聚苯乙烯乳膠制備番鴨小鵝瘟病乳膠凝集試劑；所述的抗GPV雜交瘤細胞株D11株，保藏在CCTCC(即：中國典型培養物保藏中心)，保藏日2011年4月15日，保藏編號：C201120。

本發明的目的還要提供番鴨小鵝病乳膠凝集試劑的應用。

與現有技術比較，應用本發明的試劑建立的乳膠凝集試驗(latex?particle?agglutination，LPA)可用于臨床診斷番鴨小鵝瘟病和鵝細小病毒(GPV)抗原鑒定；同時，根據該凝集試驗能被小鵝瘟抗體特異抑制的原理，建立的乳膠凝集抑制試驗(latex?particle?agglutination?inhibition，LPAI)還可用于小鵝瘟病的血清學調查和疫苗免疫抗體監測。該試劑具有快速(檢測抗原30分鐘內出結果，檢測抗體60分鐘內出結果)、簡便(不需儀器、肉眼可判定)、特異性強(不與其它病原發生交叉反應)、敏感性好、重復性和準確率高(與病毒分離的符合率89.3％)、保存期長(4℃～8℃保存一年)等優點。因此，本發明的番鴨小鵝瘟病乳膠凝集試劑，既可檢測病原，也可檢測抗體。

具體實施方式

以下結合具體實施例對本發明進一步說明(但不是對本發明的限制)。并通過定性或定量的實驗數據證明本發明的技術方案可以實現所述的用途和/或達到預期效果。

番鴨小鵝瘟病乳膠凝集試劑的制備方法如下：

將10％聚苯乙烯乳膠用0.1M?pH8.2甘氨酸緩沖液(GBS)稀釋至1％，6000r/min離心5min，棄上清液，沉淀物用0.1M?pH8.2GBS重懸到原體積，加等體積抗GPV單克隆抗體(蛋白濃度0.5～1mg/ml)，充分混勻，置37℃水浴箱中感作40min(每10min搖動數秒鐘)后，用含1％牛血清白蛋白(BSA)的0.1M?pH8.2GBS洗2次，每次以6000r/min離心5min，沉淀重懸于0.1％BSA-GBS使乳膠終濃度為1％，并加入疊氮鈉至終濃度為0.025％，即成番鴨小鵝瘟病乳膠凝集試劑。

其中：

1.抗番鴨源鵝細小病毒單克隆抗體的制備：

從液氮中取出抗GPV雜交瘤細胞株D11株，放入預先準備的37℃溫水中，使其盡快融化后，1000r/min離心2min，棄凍存液，以細胞營養液(HT-D7777-10％FCS)重懸細胞后，將細胞移至預先加好細胞營養液的培養瓶中，37℃?CO₂?6.0溫箱中培養，經擴大培養到足夠數量時，收集細胞離心，調細胞濃度達5×10⁶個細胞/ml。腹腔接種12周齡BALB/c小鼠，5×10⁵個細胞/0.1ml/只，約10天左右小鼠腹部明顯臌起，以手觸摸時皮膚有緊張感，即可用16～18號消毒針頭采集腹水。將腹水10?000r/min離心15min，棄沉淀，收集上清即為抗GPV單克隆抗體，經Commassi?brilliant?blue(考馬斯亮藍R-250)法測定抗體蛋白濃度，分裝，-20℃以下保存備用。

2.乳膠凝集試劑制備

2.1抗體稀釋：以0.1M?pH8.2甘氨酸緩沖液(GBS)將抗GPV單克隆抗體(腹水)稀釋成含蛋白濃度1.0～0.5mg/ml，備用。