[發明專利]一種黃檗轉基因體系建立的方法

無效

• 申請號: 201110166079.1
• 申請日: 2011-06-20
• 公開（公告）號: CN102260705A
• 公開（公告）日: 2011-11-30
• 發明（設計）人: 李成浩;楊靜莉;趙波;劉桂豐;靳春蓮;周晨光;劉立輝;杜佳;李春燕
• 申請（專利權）人: 東北林業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 金永煥

1.一種黃檗轉基因體系建立的方法，其特征在于黃檗轉基因體系建立的方法按以下步驟實現：一、將黃檗去皮后的成熟種子在超凈工作臺內用體積濃度為70％的酒精浸泡30s～1min，滅菌水沖洗2～3遍，然后轉入質量濃度為1％的NaClO溶液中消毒10～20min，滅菌水沖洗3～5遍，再接種到含4mg/L苯基噻二唑脲、0.2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和5.5g/L瓊脂的MS培養基上培養1～3天；

二、將含GUS基因的載體pCAMBIA1303利用電轉方法轉到根癌農桿菌EHA105中，獲得含GUS基因的工程菌，然后接種到LB培養基上培養至菌液的OD₆₀₀值為0.5～1.0，再稀釋至菌液的OD₆₀₀值為0.1，以5000r/min的轉速離心5min，棄上清后加入等體積的含4mg/L苯基噻二唑脲、0.2mg/L萘乙酸和30g/L蔗糖的MS培養基并混勻，獲得侵染液，然后倒入培養皿中，再放入步驟一中培養后的種子，將種子末端的子葉先切去，然后沿著胚軸縱切成兩半，侵染30min后取出種子接種到含4mg/L苯基噻二唑脲、0.2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和5.5g/L瓊脂的MS培養基上培養1～3天，然后剝離胚乳并用滅菌水沖洗帶子葉的下胚軸3～5遍，再放入含200mg/L頭孢霉素的滅菌水中進行脫菌；

三、脫菌后的種子接種到含10mg/L卡那霉素、200mg/L頭孢霉素、1mg/L苯基噻二唑脲、0.2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和5.5g/L瓊脂的MS培養基中培養1個月，獲得抗性芽；

四、將抗性芽接種到含0.5mg/L?6-芐氨基嘌呤、0.2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和5.5g/L瓊脂的1/2MS培養基中培養至抗性芽高于3cm，然后轉接于含1mg/L乙哚丁酸、30g/L蔗糖和5.5g/L瓊脂的1/2MS培養基中進行生根培養，再挑選根系發達的植株移栽到栽培基質中，澆透水并覆蓋塑料膜，在21℃培養室中培養6周后去掉覆蓋的塑料膜，獲得黃檗轉基因再生植株，即完成黃檗轉基因體系建立。

2.根據權利要求1所述的一種黃檗轉基因體系建立的方法，其特征在于步驟一中將黃檗去皮后的成熟種子在超凈工作臺內用體積濃度為70％的酒精浸泡30s～1min，滅菌水沖洗2～3遍，然后轉入質量濃度為1％的NaClO溶液中消毒10～20min。

3.根據權利要求1所述的一種黃檗轉基因體系建立的方法，其特征在于步驟四中栽培基質按體積份數比由1份滅菌的沙子和3份滅菌的泥土組成。