[發(fā)明專(zhuān)利]一種檢測(cè)單胺氧化酶含量的方法和試劑盒

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110162610.8
• 申請(qǐng)日: 2011-06-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102262066A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-11-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 董理
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 董理
• 主分類(lèi)號(hào): G01N21/33
• 分類(lèi)號(hào): G01N21/33
• 代理公司: 北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 逯長(zhǎng)明

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是涉及一種檢測(cè)單胺氧化酶含量的方法和試劑盒。

背景技術(shù)

單胺氧化酶(monoamine?oxidase，MAO)為催化單胺氧化脫氨反應(yīng)的酶。也稱為含黃素胺氧化酶，可使兒茶胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)失活的酶，可用作抗抑郁癥藥物。血清單胺氧化酶的活性高低能反映肝纖維化的程度，是診斷肝硬化的重要指標(biāo)。肝硬化患者血清單胺氧化酶活性升高的陽(yáng)性率在80％以上，最高值可超過(guò)對(duì)照參考值的兩倍，而且血清單胺氧化酶活性升高與肝表面結(jié)節(jié)形成的進(jìn)程相平行。各型肝炎急性期患者血清單胺氧化酶活性不增高，但暴發(fā)性重癥肝炎或急性肝炎中有肝壞死時(shí)，由于線粒體破壞，血清單胺氧化酶活性可升高。單胺氧化酶活性升高還可見(jiàn)于甲亢、糖尿病合并脂肪肝、充血性心衰、肢端肥大癥等疾病。

目前，血清單胺氧化酶的測(cè)定方法有很多，包括熒光法、免疫抑制法和化學(xué)光度法。熒光測(cè)定法是以色胺作為底物，經(jīng)MAO催化脫氨生成吲哚乙酸，后者經(jīng)醛脫氫酶作用生產(chǎn)吲哚乙醛，并使其輔酶NAD⁺還原為NADH，用280nm的激發(fā)波長(zhǎng)于370nm處測(cè)定熒光度。免疫抑制法是用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，向包被抗MAO抗體的微孔中依次加入樣品或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗MAO抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成黃色。顏色的深淺和樣品中的MAO呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品濃度。化學(xué)光度法是以無(wú)色芐胺為底物，經(jīng)MAO氧化生成芐醛，再與2，4-二硝基苯肼生成醛苯腙，后者在堿性環(huán)境下呈棕紅色，且顏色的深淺和樣品中的MAO呈正相關(guān)。

然而，上述方法操作步驟繁瑣、檢測(cè)儀器和試劑昂貴，不適合作為常規(guī)生化檢驗(yàn)項(xiàng)目在臨床上應(yīng)用。

隨著各種半、全自動(dòng)生化分析儀的普遍應(yīng)用，近年來(lái)研制出酶比色法測(cè)定單胺氧化酶，它的反應(yīng)原理為：

然后，在340nm波長(zhǎng)下測(cè)定還原型輔酶NADH吸光度每分鐘的下降速度，計(jì)算出單胺氧化酶的濃度。這種測(cè)定單胺氧化酶的方法廣泛適用于各種半、全自動(dòng)生化分析儀的普遍應(yīng)用被廣泛應(yīng)用。然而上述測(cè)定方法需經(jīng)過(guò)氧化氫路線測(cè)定丙酮酸的濃度，過(guò)氧化氫穩(wěn)定性差，致使檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性降低。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明目的是提供一種準(zhǔn)確性高的檢測(cè)單胺氧化酶含量的方法和試劑盒。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種檢測(cè)單胺氧化酶的方法，為在pH8.8～9.0緩沖液中，胺類(lèi)化合物在待測(cè)樣品中的單胺氧化酶的作用下發(fā)生氧化反應(yīng)生成氨，生成的氨在谷氨酸脫氫酶作用下與α-酮戊二酸反應(yīng)消耗還原型輔酶；在340nm波長(zhǎng)下檢測(cè)并記錄反應(yīng)液中還原型輔酶吸光度變化速率，計(jì)算待測(cè)樣品中單胺氧化酶的含量。

本發(fā)明所述檢測(cè)方法胺類(lèi)化合物在待測(cè)樣品中的單胺氧化酶的作用下發(fā)生氧化反應(yīng)生成氨，生成的氨在谷氨酸脫氫酶作用下與α-酮戊二酸反應(yīng)消耗還原型輔酶，生成谷氨酸和氧化型輔酶。反應(yīng)式為：

還原型輔酶吸光度下降速度與待測(cè)樣品中的單胺氧化酶呈正相關(guān)，通過(guò)340nm波長(zhǎng)反應(yīng)液吸光度變化速率可以計(jì)算待測(cè)樣品中的單胺氧化酶的含量。

由于單胺氧化酶與胺類(lèi)化合物的反應(yīng)的速率是成線性的，即每分鐘的吸光度變化率是不變的，因此可以根據(jù)3～5min后的吸光度變化率得到整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中吸光度變化率，從而計(jì)算待測(cè)樣品中的MAO的含量，計(jì)算公式為：C_樣＝ΔA_樣/分鐘×K。其中，C_樣為待測(cè)樣品濃度；ΔA_樣/分鐘為樣本每分鐘吸光度變化率；K為理論因數(shù)。

本發(fā)明所述檢測(cè)方法不經(jīng)過(guò)氧化氫路線，而是利用谷氨酸脫氫酶作用測(cè)定與氨反應(yīng)的還原型輔酶的下降速度計(jì)算單胺氧化酶的含量，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

由于樣品本身含有丙酮酸，在反應(yīng)過(guò)程中消耗還原型輔酶，可能對(duì)還原型輔酶吸光度下降速度造成影響，進(jìn)而影響待測(cè)樣品中MAO檢測(cè)的準(zhǔn)確性。因此本發(fā)明所述檢測(cè)方法還包括過(guò)量的乳酸脫氫酶與待測(cè)樣品混合，催化內(nèi)源性丙酮酸發(fā)生還原反應(yīng)。

在pH8.8～9.0的緩沖液中，乳酸脫氫酶催化樣品內(nèi)源性丙酮酸發(fā)生還原反應(yīng)生成乳酸，除去待測(cè)樣品中的內(nèi)源性丙酮酸，使還原型輔酶在3～5min內(nèi)達(dá)到恒定水平，反應(yīng)式為：