[發(fā)明專利]臨床及實(shí)驗(yàn)用無異種蛋白干細(xì)胞培養(yǎng)基添加物及用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110159593.2
• 申請日: 2011-06-04
• 公開（公告）號(hào): CN102250838A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 云升;邱英
• 申請（專利權(quán)）人: 內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N5/0789
• 分類號(hào): C12N5/0789;C12N5/0775
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種臨床及實(shí)驗(yàn)用高效無異種蛋白干細(xì)胞培養(yǎng)基添加物及其用途，具體來說，本發(fā)明公開一種可用于體外擴(kuò)增培養(yǎng)人臍帶或骨髓造血干/祖細(xì)胞的培養(yǎng)基添加物，培養(yǎng)基添加物由人臍帶或胎盤提取液和體積百分比為10％的人臍帶血漿組成，所述人臍帶或胎盤提取液的終濃度為0.10-0.45mg/ml。該培養(yǎng)基添加物還能用于體外擴(kuò)增人臍帶或骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

背景技術(shù)

干細(xì)胞是生物體內(nèi)存在的一種具有自我更新能力和多系分化潛能的原始細(xì)胞群體，人體所有的組織器官細(xì)胞均由干細(xì)胞分化而來。隨著對干細(xì)胞研究的不斷深入，其臨床應(yīng)用價(jià)值也越來越受到重視。因其具有組織修復(fù)，細(xì)胞再生，免疫調(diào)節(jié)和免疫重建等功能，使其廣泛應(yīng)用于神經(jīng)、骨關(guān)節(jié)、腎病、糖尿病、移植及腫瘤治療等各個(gè)領(lǐng)域。但干細(xì)胞不論源于自體還是異體，數(shù)量很少，不能滿足臨床應(yīng)用要求，多需要從體外培養(yǎng)擴(kuò)增。因此培養(yǎng)基必須滿足干細(xì)胞對營養(yǎng)成分、促生長因子、激素、滲透壓、pH等諸多方面的要求。因此，干細(xì)胞培養(yǎng)要求較高，其中，臍帶血干細(xì)胞的培養(yǎng)條件更為苛刻，也更難控制，易凋亡、分化。目前市面上昂貴的工業(yè)化生產(chǎn)的無血清培養(yǎng)基也無法為臍帶血干細(xì)胞生長提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)和最佳的細(xì)胞因子比例，干細(xì)胞擴(kuò)增受限且易于凋亡。

臍帶造血干細(xì)胞具有多能分化特性，臨床應(yīng)用潛力極大，特別是白血病等癌癥放化療后的造血干細(xì)胞移植，但因其造血干/祖細(xì)胞數(shù)量少，無法滿足臨床應(yīng)用。長期以來各國學(xué)者竭力研究其培養(yǎng)條件以利大量擴(kuò)增供臨床應(yīng)用(Piacibello?W，Sanavio?F，Garetto?L.et?al.Extensive?amplification?and?self?renewal?of?human?primitive?hematopoietic?stem?cells?from?cord?blood.Blood，89：2644-2653)。美國已有以臍帶血清作為培養(yǎng)基添加劑的專利(US7060494)，但它仍需加入多種昂貴的細(xì)胞因子，而且擴(kuò)增所需時(shí)間長，且易分化。我們做了大量的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行比較，它比現(xiàn)有的無血清和常規(guī)的含有胎牛血清(FBS)培養(yǎng)基都好。但它們的共同問題仍是細(xì)胞分化和部分造血祖細(xì)胞喪失，超過3周后，培養(yǎng)的臍帶血有核細(xì)胞同樣發(fā)生分化或凋亡，同時(shí)紅系集落形成在10天后完全消失，所以仍然無法滿足臍帶造血干細(xì)胞移植所需的細(xì)胞量。我們也測試了Invitrogen公司新近開發(fā)的基質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，主要用于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)或來源于成人骨髓間充質(zhì)(MSC)干細(xì)胞的培養(yǎng)。它也可以擴(kuò)增臍帶血有核細(xì)胞9倍左右，但沒有臨床應(yīng)用價(jià)值，因?yàn)榕囵B(yǎng)10天后就喪失了紅系集落形成能力。

迄今為止，雖然大多數(shù)培養(yǎng)基都可以擴(kuò)增臍帶血有核細(xì)胞，但都無法在短時(shí)間內(nèi)有效地?cái)U(kuò)增臍帶造血干/祖細(xì)胞，特別是紅系造血干細(xì)胞/前體細(xì)胞，所以臨床臍帶血移植治療成人白血病和其他惡性腫瘤結(jié)果不十分滿意。

發(fā)明內(nèi)容

基于目前干細(xì)胞培養(yǎng)基的缺陷及臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究的需求，我們利用廢棄的人類臍帶、胎盤以及臍帶血漿做干細(xì)胞培養(yǎng)基添加劑，發(fā)明了這種高效、無異種蛋白培養(yǎng)基，適用于各種干細(xì)胞培養(yǎng)，也可直接用于臨床；而且取材方便，價(jià)格低廉，對于干細(xì)胞培養(yǎng)和臨床應(yīng)用有著深遠(yuǎn)的意義。本發(fā)明用臍帶血漿和臍帶及胎盤提取液做干細(xì)胞培養(yǎng)基添加物，并非單純血清，所以保存了所有的干細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)成分和細(xì)胞因子，另外各種物質(zhì)的比例處于完全自然的干細(xì)胞生長狀態(tài)，在國內(nèi)、外尚未報(bào)道。

本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供臨床及實(shí)驗(yàn)用無異種蛋白干細(xì)胞培養(yǎng)基添加物，包括人臍帶或胎盤提取液和體積百分比為10％的人臍帶血漿，所述人臍帶或胎盤提取液的終濃度為0.10-0.45mg/ml。作為更為優(yōu)選的實(shí)施方案，臍帶或胎盤提取液的終濃度為0.25、0.3或0.45mg/ml。

本發(fā)明具體提供一種臍帶或胎盤提取物的制備方法，其具體步驟為：用生理鹽水、抗生素、生理鹽水依次清洗胎盤和臍帶，在冰槽內(nèi)將其切成1-2cm大小的組織塊，在冰凍狀態(tài)將組織粉碎，按2ml/g的比例加入RPMI?1640，4℃離心，保存上清液，速凍沉淀部分，重復(fù)粉碎、離心步驟，混合上清液。