[發明專利]定量湖泊沉積物中氨氧化古菌的方法

無效

• 申請號: 201110157937.6
• 申請日: 2011-06-14
• 公開（公告）號: CN102230009A
• 公開（公告）日: 2011-11-02
• 發明（設計）人: 趙大勇;馬婷;燕文明;姜翠玲;徐于楠;黃睿;王猛
• 申請（專利權）人: 河海大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06;G01N21/64
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀昌

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技術領域

本發明屬于環境微生物生態學技術領域，具體涉及一種定量測定湖泊沉積物中氨氧化古菌的方法。

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背景技術

當前，淡水湖泊的富營養化問題已成為我國所面臨的重要環境問題之一，氮、磷等營養元素的過量輸入是導致湖泊富營養化的重要原因。因此，研究氮素在湖泊生態系統中的生物地球化學循環規律可以為闡明湖泊富營養化的形成機理并尋找相應的控制措施提供依據。湖泊沉積物是淡水生態系統的重要組成部分，也是大量微生物類群的棲息地，這些微生物類群在湖泊中氮、磷等營養元素循環方面發揮著重要的作用，對于維持湖泊生態系統的健康和穩定具有重要的意義。

湖泊生態系統中的氮循環包括硝化、反硝化等復雜過程。硝化作用是其中非常關鍵的一個環節，包括兩個反應步驟，第一個步驟是將氨氧化成亞硝酸鹽，第二個步驟是將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽。第一步氨氧化過程是整個反應的限速步驟，主要由氨氧化細菌（Ammonia?oxidizing?bacteria，AOB）和氨氧化古菌（Ammonia?oxidizing?archaea，AOA）這兩類微生物完成。與AOB相比，AOA不論是在數量、多樣性及其棲居范圍等各方面都高于AOB。因此，對于湖泊沉積物中AOA的定量研究有助于闡明湖泊沉積物中氮循環作用的相關機理。

很長一段時間以來，對于環境樣品中微生物的數量及多樣性的研究主要依賴分離培養和顯微鏡觀察等傳統方法。這些傳統方法周期長、誤差大，無法準確地反映湖泊沉積物中氨氧化古菌的數量。因此，迫切需要有新的方法對AOA進行定量表征，只有這樣才能在此基礎上進一步探索緩解湖泊富營養化的新方法。

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發明內容

本發明的目的在于克服傳統技術的缺陷，而提供一種湖泊沉積物中氨氧化古菌的熒光定量PCR檢測方法。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：

（1）DNA的提取

采集湖泊沉積物樣品并進行冷凍干燥。稱取5?g凍干之后的沉積物樣品放入50?mL離心管中，加入9?mL無菌水，2?mL?Tris-HCl緩沖液，2.5?mL?EDTA溶液和5?mL?10%?SDS溶液。混合后，65℃水浴60?min。12000?rpm室溫離心10?min。上清液收集在50?mL離心管中，加入3?mL?5M?NaCl和2?mL?10%?CTAB溶液和10?mL蛋白酶K，輕微混勻，65℃水浴保溫20?min。上清液中加入16?mL?氯仿:異戊醇混合液（24：1體積比），輕微混勻1?min，3000?rpm室溫離心5?min。將上層水相移入50?mL離心管，加入0.1倍體積3M?NaAc和0.6倍體積異丙醇，輕微混勻，4℃冰浴60?min，4℃下12000?rpm離心20?min。棄去上清液，沉淀用5?mL?75%乙醇洗滌，12000?rpm?（4℃）再離心10?min。棄去上清液，沉淀風干，溶解于50?mL?TE緩沖液（pH?8.0）。

（2）氨氧化古菌質粒標準品的構建及樣品分析

通過氨氧化古菌特異性引物Arch-amoAF和Arch-amoAR對提取得到的DNA進行擴增。擴增反應體系為50?mL，包含10×PCR緩沖液5?mL，2.5?mM?Mg²⁺?4?mL，4?mL?dNTPs?（各2.5?mM），上下游引物各1?mL（10?mM），Taq?DNA聚合酶2?U。擴增反應程序為：94℃預變性5?min，94℃變性1?min，53℃退火1?min，72℃延伸1.5?min，共45個循環，最后在72℃延伸10?min。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用Axygen凝膠回收試劑盒進行切膠純化，純化后的產物與Promega公司的pGEM?T-Easy載體在4℃連接過夜。連接產物轉化至感受態細胞（DH5a）并涂平板培養過夜。在平板上挑取白色單克隆菌落用LB培養基進行擴大培養，用Axygen的小量質粒提取試劑盒提取質粒，經PCR驗證后在紫外分光光度計上測定其濃度并換算為氨氧化古菌的拷貝數，-20℃保存備用。