[發(fā)明專利]利用人工調控元件及其文庫調控微生物染色體上基因表達強度的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110155176.0
• 申請日: 2011-06-10
• 公開（公告）號: CN102286517A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發(fā)明（設計）人: 張學禮;朱欣娜;李清艷;盧焦;趙婧
• 申請（專利權）人: 天津工業(yè)生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/67
• 分類號: C12N15/67;C12N15/10;C12N15/09
• 代理公司: 暫無信息
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1.一種利用人工調控元件文庫調控微生物染色體上基因表達強度的方法，包括以下步驟：

將微生物染色體上待調控基因的原始調控區(qū)域替換為人工調控元件文庫。

所述微生物染色體上待調控基因為微生物染色體上的內源基因和整合到微生物染色體上的外源基因。

所述人工調控元件文庫為啟動子文庫、啟動子與核糖體結合位點之間的信使RNA穩(wěn)定區(qū)文庫、核糖體結合位點文庫、啟動子上游區(qū)文庫中的一種或幾種。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：

所述啟動子文庫為一段含有隨機堿基的DNA序列，其包括一個含6個特定堿基或6個隨機堿基的啟動子-35核心區(qū)域、一個含6個特定堿基或6個隨機堿基的啟動子-10核心區(qū)域、一個在-35和-10核心區(qū)域之間的含10-20個特定堿基或10-20個隨機堿基的中間區(qū)域、一個含特定堿基的啟動子上游區(qū)、一個含特定堿基的信使RNA穩(wěn)定區(qū)、一個含特定堿基的核糖體結合位點。

所述信使RNA穩(wěn)定區(qū)文庫為一段含有隨機堿基的DNA序列，其包括一個含特定堿基的啟動子上游區(qū)、一個含特定堿基的啟動子、一個在啟動子與核糖體結合位點之間的含5-50個隨機堿基的信使RNA穩(wěn)定區(qū)、一個含特定堿基的核糖體結合位點。

所述核糖體結合位點文庫為一段含有隨機堿基的DNA序列，其包括一個含特定堿基的啟動子上游區(qū)、一個含特定堿基的啟動子、一個含特定堿基的信使RNA穩(wěn)定區(qū)、一個含6-20個隨機堿基的核糖體結合位點。

所述啟動子上游區(qū)文庫為一段含有隨機堿基的DNA序列，其包括一個在啟動子-35核心區(qū)域上游的含5-1000個隨機堿基的區(qū)域、一個含特定堿基的啟動子、一個含特定堿基的信使RNA穩(wěn)定區(qū)、一個含特定堿基的核糖體結合位點。

3.根據權利要求1-2所述的方法，其特征在于：

所述啟動子文庫的序列為序列表中的序列1和序列2。

所述信使RNA穩(wěn)定區(qū)文庫的序列為序列表中的序列9。

所述核糖體結合位點文庫的序列為序列表中的序列18。

所述啟動子上游區(qū)文庫的序列為序列表中的序列17。

4.根據權利要求1-3所述的方法，其特征在于：

所述將微生物染色體上待調控基因的原始調控區(qū)域替換為人工調控元件文庫，包括以下步驟：

通過PCR的方法擴增出一段DNA片段，其包括與微生物染色體上待調控基因原始調控區(qū)域上游序列同源的一段含40-3000個堿基的片段(作為左同源臂)、抗性標記基因、人工調控元件文庫、與微生物染色體上待調控基因起始密碼子下游序列同源的一段含40-3000個堿基的片段(作為右同源臂)。使用同源重組的方法，將微生物染色體上待調控基因的原始調控區(qū)域替換為抗性標記基因和人工調控元件文庫。

所述抗性標記基因為氨芐青霉素抗性基因、卡納霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因、安普霉素抗性基因中的一種或幾種。

5.根據權利要求1-4所述的方法，其特征在于：

所述微生物為大腸埃希氏菌(Escherichia?coli)。

所述微生物染色體上待調控基因為大腸埃希氏菌的β-半乳糖苷酶基因(lacZ)、1-脫氧-木酮糖5-磷酸合成酶基因(dxs)。

6.一種人工調控元件的構建方法，包括以下步驟：

將微生物染色體上標記基因的原始調控區(qū)域替換為人工調控元件文庫，獲得一系列具有不同調控強度的人工調控元件。通過測定該標記基因編碼蛋白的活性，確定各個人工調控元件的強度。

所述微生物染色體上標記基因為微生物染色體上的內源基因和整合到微生物染色體上的外源基因。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于：

所述微生物為大腸埃希氏菌(Escherichia?coli)。

所述微生物染色體上標記基因為大腸埃希氏菌的β-半乳糖苷酶基因(lacZ)。