[發明專利]一種與植物抗低溫相關的miRNA——gma-miR169c及其應用

無效

• 申請號: 201110154909.9
• 申請日: 2011-06-10
• 公開（公告）號: CN102220329A
• 公開（公告）日: 2011-10-19
• 發明（設計）人: 李霞;王幼寧;陳亮;石磊;李東曉
• 申請（專利權）人: 中國科學院遺傳與發育生物學研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;A01H5/00
• 代理公司: 石家莊匯科專利商標事務所 13115
• 代理人: 王琪;周大偉

技術領域

本發明涉及一種與植物抗低溫相關的miRNA，尤其是一種來源于大豆的、能夠調節大豆抗低溫性的miRNA；本發明還涉及此miRNA的前體及用途。

背景技術

大豆是非常重要的、具有特殊經濟價值的作物。低溫等環境脅迫對大豆的生長發育具有重要影響，嚴重時會造成大豆大規模減產。解析大豆抵抗低溫的分子機制，培育耐低溫的大豆品種是目前大豆種植業的主要目標之一。目前，應用基因工程育種已經成為增強作物耐低溫性的重要手段。高等植物在應答低溫脅迫時啟動了多種應答網絡，研究表明，microRNA（miRNA）在其中也具有非常重要的作用。

miRNA是近年來研究發現的一種長20～24?nt的內源性非蛋白編碼RNA。miRNA基因最初轉錄產生具有頸環結構的pre-miRNAs。隨后pre-miRNA被轉運出核，在細胞質中被Dicer酶作用，加工成成熟的miRNA。通過序列互補與特定靶基因的mRNA結合，引起mRNA降解或抑制mRNA翻譯從而對基因的表達起到負調節作用(Llave?et?al.,?2002;?Palatnik?et?al.,?2003;?Tang?et?al.,?2003)。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種與植物抗低溫相關的miRNA及其前體序列，利用此miRNA能夠提高大豆的抗低溫性，對提高大豆產量具有重大的意義。

為解決上述技術問題，本發明所采取的技術方案如下。

一種與植物抗低溫相關的miRNA，其具有序列表中SEQ?ID?NO：1所示的序列。

上述與植物抗低溫相關的miRNA的前體序列，其具有序列表中SEQ?ID?NO：2所示的序列。

上述與植物抗低溫相關的miRNA在培育抗低溫轉基因植物中的應用。

作為上述應用的一種優選技術方案，所述抗低溫轉基因植物為大豆。

作為上述應用的一種優選技術方案，在大豆中過表達SEQ?ID?NO：1所示的miRNA，或抑制SEQ?ID?NO：1所示miRNA的表達，培育出具有高抗低溫性的轉基因大豆。

采用上述技術方案所產生的有益效果在于：本發明miRNA的表達受到低溫脅迫的調節，說明其在大豆適應低溫脅迫機制中起重要作用，基于此，可利用其培育具有高抗低溫性的轉基因大豆，對提高大豆產量具有重大的意義。

附圖說明

圖1為gma-miR169c前體序列的莖環結構圖，可見其前體序列折疊成一種穩定的莖環結構，屬于miRNA前體典型的二級結構，符合miRNA前體的結構特征。

圖2?為低溫脅迫條件下gma-miR169c在根及根瘤中的表達特征的定量PCR結果。

圖3?為用大豆毛狀根轉化體系檢測到的gma-miR169c在大豆根中對低溫脅迫的響應。

具體實施方式

以下實施例詳細說明了本發明。本發明所使用的各種原料及各項設備均為常規市售產品，均能夠通過市場購買直接獲得。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。

實施例1、實時熒光定量PCR分析gma-miR169c在低溫脅迫下的表達特性

一、脅迫處理

脅迫根瘤材料按照以下流程進行：Wilimas82大豆種子用70%的灑精滅菌30?S，dH2O沖洗6遍后播種于無菌培養皿中，皿底置2張無菌濾紙，dH2O浸濕，28?℃暗萌發3天。芽長至2?cm時，移至放有濕潤濾紙的試管中，芽長至4～5?cm，移至活化的根瘤菌菌液中，接種30?min，低N水培，10,?000?lux，溫度為26?℃，相對濕度為70%，培養28天，脅迫處理，取根瘤。低溫處理：4℃處理24小時后取根瘤，于液氮速凍，-80℃保存備用。

二、miRNA的分離

取根瘤，用microRNA提取試劑盒（百泰克公司）（Cat?#?RP5301）提取小片段RNA，提取方法如下：

（1）勻漿處理

根瘤用液氮內研缽快速磨碎，每50～100?mg組織加1?ml裂解液后勻漿。

（2）將勻漿樣品劇烈震蕩混勻，在15?-30?℃條件下孵育5?min以使核蛋白體完全分解。

（3）4?℃的條件下12,?000?rpm?離心10?min，小心取上清轉入一個新的RNase?free的離心管中。

當樣品富含蛋白質、脂肪、多糖時，可離心10?min，移除勻漿中不溶解的物質，余下的沉淀中包含有細胞外膜、多糖、以及高分子量DNA，而上層的超浮游物含有RNA。