[發(fā)明專利]一種同時(shí)高效表達(dá)雙基因的真核表達(dá)載體

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110152419.5
• 申請(qǐng)日: 2011-06-08
• 公開（公告）號(hào): CN102816789A
• 公開（公告）日: 2012-12-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 易銀沙
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 易銀沙
• 主分類號(hào): C12N15/79
• 分類號(hào): C12N15/79
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種同時(shí)高效表達(dá)兩個(gè)基因的真核表達(dá)載體，可以用于基因功能研究及基因治療用途。

背景技術(shù)

真核表達(dá)是基因功能研究中最常用的研究手段之一。在利用真核表達(dá)載體表達(dá)欲研究的外源基因時(shí)，經(jīng)常會(huì)需要同時(shí)表達(dá)兩個(gè)基因。例如，在表達(dá)目的基因用于研究的同時(shí)，再表達(dá)一個(gè)熒光基因，用來作為細(xì)胞轉(zhuǎn)染指示，以監(jiān)測(cè)該真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞的效率。又或者，需要同時(shí)表達(dá)兩個(gè)欲研究的目的基因，以研究這兩個(gè)基因的協(xié)同作用效應(yīng)。

雖然，可以通過構(gòu)建兩個(gè)單獨(dú)的真核表達(dá)載體，然后共轉(zhuǎn)染至同一瓶細(xì)胞中，以實(shí)現(xiàn)上述目的，但是，由于兩種質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑混合時(shí)的不均一性，以及不同質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞效率的差異，這種共轉(zhuǎn)染經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)較大的實(shí)驗(yàn)誤差，而要盡量消除這種誤差，則需要同時(shí)做多組平行樣，計(jì)算其平均值。這樣無疑大大增加了工作量和實(shí)驗(yàn)成本。

而如果能在同一個(gè)載體上實(shí)現(xiàn)兩個(gè)基因的同時(shí)表達(dá)，則不需要做共轉(zhuǎn)染，只需要轉(zhuǎn)染一個(gè)質(zhì)粒即可，因此能夠很好地解決上述問題。

目前，在同一個(gè)載體上實(shí)現(xiàn)兩個(gè)基因的同時(shí)表達(dá)，有幾種方法，但是都有各自的缺點(diǎn)和不足。

一種方法是，將兩個(gè)基因融合在一起表達(dá)，中間間以數(shù)個(gè)氨基酸作為L(zhǎng)inker。這種方法，兩個(gè)基因的表達(dá)水平基本一致，但是缺點(diǎn)是，由于兩個(gè)蛋白彼此融合在一起，所以有可能會(huì)互相影響彼此的空間折疊，從而導(dǎo)致蛋白功能下降甚至失效。例如這種載體的代表pEGFP-N1，在EGFP前面插入另一個(gè)外源基因后，綠色熒光則往往會(huì)變?nèi)酢?/p>

另一種方法，是利用IRES元件，將兩個(gè)基因串聯(lián)起來。兩個(gè)基因在mRNA水平基本一致，而且會(huì)各自單獨(dú)翻譯，互不影響。但是這種方法的缺點(diǎn)是，IRES后面的基因表達(dá)量偏低，往往只有前面基因表達(dá)量的三分之一到二分之一。所以這種方法雖然能夠?qū)崿F(xiàn)一個(gè)載體同時(shí)表達(dá)兩個(gè)基因的目的，但是其并不是高效的，其中一個(gè)基因的表達(dá)量是比較低的。

因此，非常有必要開發(fā)一種新型的表達(dá)載體，能夠既同時(shí)高效表達(dá)兩個(gè)外源基因，且兩個(gè)基因表達(dá)相對(duì)獨(dú)立，不會(huì)互相影響。

發(fā)明內(nèi)容

為實(shí)現(xiàn)既同時(shí)高效表達(dá)兩個(gè)外源基因，且兩個(gè)基因表達(dá)相對(duì)獨(dú)立，不會(huì)互相影響的目的，本發(fā)明提供了一種雙表達(dá)框載體，可以簡(jiǎn)單、方便地同時(shí)高效表達(dá)兩個(gè)外源基因。

將如下結(jié)構(gòu)構(gòu)建至同一個(gè)真核表達(dá)載體上：1）由CMV啟動(dòng)子調(diào)控的外源基因表達(dá)框結(jié)構(gòu)，即CMV啟動(dòng)子+MCS1（多克隆位點(diǎn)1）+BGH?PolyA；2）由hEF1α啟動(dòng)子調(diào)控的外源基因表達(dá)框結(jié)構(gòu)，即hEF1α啟動(dòng)子+MCS2（多克隆位點(diǎn)2）+SV40?PolyA。

上述載體中還包括Kan原核抗性篩選標(biāo)記，以及Neo真核抗性篩選標(biāo)記。

根據(jù)上述技術(shù)方案，本發(fā)明提供了一個(gè)真核表達(dá)載體，序列如SEQ?NO?1所示。

利用本發(fā)明提供的真核表達(dá)載體，可以簡(jiǎn)單方便地將兩個(gè)不同的外源基因分別插入兩個(gè)MCS（多克隆位點(diǎn)），置于CMV啟動(dòng)子或hEF1α啟動(dòng)子的調(diào)控下。由于CMV啟動(dòng)子是目前已知的最強(qiáng)真核啟動(dòng)子之一，而hEF1α啟動(dòng)子也是一個(gè)很強(qiáng)的啟動(dòng)子，所以本載體可以很好地實(shí)現(xiàn)兩個(gè)基因的同時(shí)、高效表達(dá)。

附圖說明

圖1?是本發(fā)明所涉及的雙表達(dá)框載體pYr-adshuttle-3的質(zhì)粒圖譜；

圖2?是在pYr-adshuttle-3的兩個(gè)表達(dá)框中分別插入綠色熒光基因EGFP、紅色熒光基因DsRed-Monomer后，構(gòu)建得到的質(zhì)粒pYr-ads-3-EGFP-moRED轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后的熒光圖片。A為普通視野；B為綠色視野；C為紅色視野。

圖3是pYr-ads-3-EGFP-MYO1E轉(zhuǎn)染小鼠腎臟足細(xì)胞48h后的熒光圖片。A為普通視野；B為綠色視野。

圖4是不同組小鼠腎臟足細(xì)胞中MYO1E的Western-blot檢測(cè)結(jié)果。A為Western-blot檢測(cè)結(jié)果；B為讀取各條帶灰度值后，分析所得的柱狀圖。

圖5?是商業(yè)化載體pYr-adshuttle-1的質(zhì)粒圖譜。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

雙表達(dá)框載體pYr-adshuttle-3的構(gòu)建

方法：以商業(yè)化載體pYr-adshuttle-1（長(zhǎng)沙贏潤生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，如SEQ?NO?2所示）為骨架，通過一系列改構(gòu)，構(gòu)建雙表達(dá)框載體pYr-adshuttle-3。