[發(fā)明專利]一種半錨定隨機(jī)引物擴(kuò)增測序的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110152402.X
• 申請日: 2011-06-08
• 公開（公告）號: CN102226218A
• 公開（公告）日: 2011-10-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張永;胡俊鋒;陳余清
• 申請（專利權(quán)）人: 蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 安徽省蚌埠博源專利商標(biāo)事務(wù)所 34113
• 代理人: 倪波

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)和分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及一種半錨定隨機(jī)引物擴(kuò)增測序的方法。

背景技術(shù)

分子遺傳學(xué)是在分子水平上研究基因的結(jié)構(gòu)與功能，以及遺傳信息傳遞的學(xué)科。抽提、分離、純化和測定等都是分子遺傳學(xué)中的常用方法。DNA序列分析技術(shù)是一個包括DNA制備或DNA片段化、堿基分析、DNA信息翻譯的多階段過程。通常采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）或克隆載體擴(kuò)增（鳥槍法）制備DNA片段，然后經(jīng)過化學(xué)裂解法和酶法為基礎(chǔ)的DNA序列分析技術(shù)（如全自動測序儀）明確DNA片段中堿基順序，然后對堿基序列中的信息進(jìn)行解讀。DNA制備是整個序列分析技術(shù)的核心和基礎(chǔ)。通過這個過程，可以獲得豐富的濃度待測的目標(biāo)片段、適合于堿基分析的形式以及可組成完整序列的小片段DNA。

常用的DNA序列測定方法如聚合酶鏈反應(yīng)、克隆載體擴(kuò)增等都存在一定的局限和缺點。

一般的聚合酶鏈反應(yīng)通過特異的錨定引物引發(fā)目的基因片段的擴(kuò)增。1）一般的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）僅適合于特定的目的基因的檢測，無法獲知錨定位以外的序列信息，是一種由兩端向中間的制備DNA片段的過程。2）一般的聚合酶鏈反應(yīng)需要知道要擴(kuò)增的基因的全部堿基序列，才能夠擴(kuò)增部分或全部的待測基因，是一種由已知到已知的驗證性過程。3）一般的聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增片段大小是固定的，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小和完整性有賴于所用的引物和靶序列信息。

“鳥槍法”是目前國際通用的基因組測序策略。它通過將基因組隨機(jī)碎片接入適當(dāng)?shù)妮d體，復(fù)制獲得足夠數(shù)量小片段序列，進(jìn)而測序獲得堿基序列信息，在對這些碎片進(jìn)行排序和組裝。“鳥槍法”雖然無須預(yù)知待測序，但對確定碎片在基因組中的正確位置比較困難，尤其是重復(fù)序列較多時，難以對重復(fù)片段有效的組裝定位；同時該技術(shù)對設(shè)備要求極其高，工作量巨大，只能在大型科研機(jī)構(gòu)方可進(jìn)行。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服目前DNA測序領(lǐng)域存在的設(shè)備要求高、操作繁瑣的技術(shù)缺點，提供一種簡單可行，效果確切、經(jīng)濟(jì)實用，易于推廣的半錨定隨機(jī)引物擴(kuò)增測序的方法，旨在為分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)研究提供一個操作簡單、費用低廉、快速高效的技術(shù)手段。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的，一種半錨定隨機(jī)引物擴(kuò)增測序的方法，其特征是，根據(jù)已知DNA片段核苷酸序列信息，設(shè)計不同堿基數(shù)短鏈寡核苷酸序列作為擴(kuò)增引物，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，反應(yīng)中的退火溫度為36℃～40℃，使所述擴(kuò)增引物既可以和已知序列特異錨定，又可以和已知序列上下游的未知序列進(jìn)行非特異錨定；根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳位置確定目的片段或用DNA印跡?挑選目的片段，然后進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的回收、測序及序列拼接，獲取已知片段上下游DNA序列信息。

所述擴(kuò)增引物的片段長度為10～16堿基的片段。

所述擴(kuò)增引物堿基數(shù)為10時，退火溫度為36℃～37℃；擴(kuò)增引物堿基數(shù)為12時，退火溫度為37℃～38℃；擴(kuò)增引物堿基數(shù)為14時，退火溫度為38℃～39℃；擴(kuò)增引物堿基數(shù)為16時，退火溫度為39℃～40℃。

我們采用了隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA?(Random?amplified?polymorphism?DNA，RAPD)的技術(shù)聯(lián)合一般的PCR技術(shù)設(shè)計出一種全新理念的制備DNA片段的技術(shù)。RAPD技術(shù)是Williams和Welsh等建立并發(fā)展DNA多態(tài)檢測技術(shù)，通常用作生物遺傳關(guān)系的研究。我們根據(jù)待測基因已知部分設(shè)計短鏈的寡核苷酸(10－16bp)特異引物，在較低退火溫度（36℃～40℃）條件下（一般PCR退火溫度為40℃～60℃,甚至更高），該引物既可以和待測基因已知部分根據(jù)堿基互補(bǔ)而特異結(jié)合，又可以利用短鏈的寡核苷酸引物隨機(jī)錯配率高的特點，非特異地和特異錨定位點上下游序結(jié)合；退火及延伸反應(yīng)中，當(dāng)在互補(bǔ)鏈上一定距離內(nèi)存在反向引物時，即可通過PCR反應(yīng)使兩復(fù)性位點間的DNA序列的擴(kuò)增產(chǎn)物。特異錨定位點的上下游序列都可以擴(kuò)增出來。然后設(shè)計測序引物即可把已知部分的上下游部分完成測序，再拼接成完整的基因序列。該技術(shù)克服了一般PCR不能檢測已知序列以外的未知序列的缺點，同時只涉及簡單的實驗操作，設(shè)備要求及費用低只需掌握一小部分靶序列的前驅(qū)順序就可以完成整個基因的擴(kuò)增。