[發(fā)明專利]一種測定ATP的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110151816.0
• 申請日: 2011-06-08
• 公開（公告）號: CN102818801A
• 公開（公告）日: 2012-12-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 席雪飛;胡煜;張艷楠;彭曉佳;王磊;武滿滿;唐玉姝
• 申請（專利權(quán)）人: 同濟大學
• 主分類號: G01N21/76
• 分類號: G01N21/76;G01N1/28
• 代理公司: 上海科盛知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31225
• 代理人: 林君如

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種ATP含量的測定方法，特別涉及一種利用Profile-1生物發(fā)光儀測定含菌水體、土壤、污泥中ATP含量的測定方法，以及通過測定ATP的含量間接表示出土壤中微生物量的方法。

背景技術(shù)

ATP(Adenosine?Triphosphate)是生物體內(nèi)一種特定的高能磷酸化合物。正常生物體細胞內(nèi)的ATP含量是相對穩(wěn)定的。故ATP含量與活性微生物量之比可以認為是常數(shù)。因此，ATP可以作為一種指標表征活性微生物量。ATP生物發(fā)光法是利用ATP與蟲熒光素-蟲熒光素酶反應(yīng)，產(chǎn)生光子，再用熒光檢測器檢測發(fā)光值，從而得到ATP的量。其反應(yīng)過程如下：

目前文獻報道的微生物ATP提取方法主要有3種，即熱提取法、酸提取法及有機溶劑提取法。酸提取，主要使用TCA(三氯醋酸)，TCA對細菌ATP有較高的提取效率，但是提取液中有若有大量TCA存在，會使熒光素酶因酸度過低而失活；為了降低這種作用，需對提取液進行適當?shù)南♂專沁@樣就降低了ATP測定的靈敏度。有機溶劑提取對脂肪和蛋白質(zhì)含量高的生物材料較為有利，但在提取液中不能殘留有機溶劑。因為有機溶劑是熒光素酶的抑制劑。熱提取是采用煮沸的方法提取ATP，這種方法對熒光素酶無抑制作用，但是操作復雜。在土壤中，由于大部分微生物都吸附在土壤顆粒上，在預處理過程中，不易對其進行富集也不易使之轉(zhuǎn)移到水溶液中，致使最終收集到的ATP濃度低于土壤中的實際濃度，這限制了ATP生物發(fā)光法在土壤學中的應(yīng)用。

Profile-1生物發(fā)光儀，由于體積較小，便于攜帶，主要被用于對現(xiàn)場食品成品、飲料、儀器等各種對象進行細菌總數(shù)的檢測。其檢測靈敏度高，量程可達0～10⁷cfu·mL^-1或cfu·g^-1，高于一般ATP熒光檢測儀靈敏度1～2個數(shù)量級。然而在大量的土壤樣品分析過程中，我們發(fā)現(xiàn)與Profile-1生物發(fā)光儀匹配的ATP提取方法對土壤樣品微生物中ATP的提取率較低，因此其用于檢測土壤中微生物量的靈敏度和準確性較低。這可能是因為土壤樣品成份較復雜，儀器自帶的ATP提取法不能有效提取土壤微生物中的所有ATP。

苯扎溴銨(BAB)，主要成分為溴化二甲基芐基烴銨，可貯存較長時間而效果不減，性狀穩(wěn)定。它為季銨鹽類陽離子表面活性劑，它能改變細菌細胞膜通透性，使菌體胞漿物質(zhì)外滲，阻礙其代謝而起到殺滅作用，是一種廣譜殺菌劑，廣泛用于環(huán)境消毒。

然而現(xiàn)階段，由于ATP提取方法和ATP檢測儀靈敏度和檢出線的限制，ATP生物發(fā)光法多用于全血、水環(huán)境和食品中活性微生物量的檢測。對于像土壤這樣固體樣品的ATP檢測，目前卻沒有一個快速、高效的方法，所以找到一種適用范圍更加廣泛的高靈敏度和可靠性的ATP檢測方法是非常有價值和必要的事情。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種靈敏度和準確性方面都有顯著的提高的測定ATP的方法。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

一種測定ATP的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

(1)制取樣品的待測溶液；

(2)在待測溶液中加入苯扎溴銨溶液得到混合溶液；

(3)用定量濾紙對步驟(2)得到的混合溶液進行吸取過濾，將得到的濾液放入已加入熒光素酶的過濾比色杯中；

(4)使用型號為Profile-1的生物發(fā)光儀進行ATP測定。

步驟(1)中所述的樣品的待測溶液為土樣分散液，制取過程包括以下步驟：將土樣放入滅菌水中，控制土樣的濃度為0.5～2g/ml，然后向其中加入10～15粒玻璃珠，放入搖床振蕩60min，控制轉(zhuǎn)速為160rpm，攪拌得到待測溶液。

步驟(2)具體包括以下步驟：吸取步驟(1)振蕩得到的待測溶液，加入到苯扎溴銨溶液中，控制待測溶液與苯扎溴銨溶液的體積比為1∶4，振蕩均勻即可。

所述的苯扎溴銨溶液的濃度為0.05wt％。

步驟(3)中所述的熒光素酶與濾液的體積比為1∶1。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明使用BAB改良分析法的ATP提取率高于Profile-1生物發(fā)光儀自帶的標準分析方法對于ATP的提取率，特別是對于土壤ATP檢測，本發(fā)明的方法在靈敏度和準確性方面都有顯著的提高，因此BAB改良分析法配合Profile-1生物發(fā)光儀可以應(yīng)用于各類固體樣品的ATP含量及其微生物量的檢測，具有良好的應(yīng)用前景和實用價值。

具體實施方式