[發明專利]α2-3神經氨酸酶在誘導移植免疫耐受中的應用

無效

• 申請號: 201110151402.8
• 申請日: 2011-06-08
• 公開（公告）號: CN102218135A
• 公開（公告）日: 2011-10-19
• 發明（設計）人: 彭代智;李芳;周靈
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院
• 主分類號: A61K38/47
• 分類號: A61K38/47;A61P37/06
• 代理公司: 重慶市恒信知識產權代理有限公司 50102
• 代理人: 劉小紅

技術領域

本發明屬于誘導移植免疫耐受的生物制品領域，涉及一種特異結構的神經氨酸酶，即α2-3神經氨酸酶。該酶是一種高度特異性的外切糖苷酶，主要催化α2-3糖苷鍵的水解。該酶預處理供體骨髓細胞（dBMCs），經外周靜脈輸注對異體皮膚存活時間的延長有明顯效果，在移植免疫耐受中有很好的誘導作用。

背景技術

自1953年Medawar給小鼠胚胎注射同種淋巴細胞成功誘導了獲得性移植免疫耐受以來，移植免疫學家就控制移植后的排斥反應、提高移植物質成活率進行了不斷地探索。尤其是近年來，隨著組織配型技術的成熟、外科手術方法的改進以及大量有效免疫抑制藥物的開發應用，組織器官移植的成功率進一步提高，逐漸成為許多終末期疾病的有效治療手段之一。然而，除孿生子間的移植之外，移植手術方法的提高和完善并未能保證術后移植器官的長期有功能存活，原因在于諸如急性排斥、慢性排斥、免疫抑制劑長期大量應用引起的感染及惡性腫瘤、移植物抗宿主反應等嚴重威脅受者的長期生存。因此，誘導和維持供體特異性免疫耐受被認為是最終克服移植物排斥反應的根本，也是移植免疫學領域的研究熱點和難點之一。所謂供體特異性免疫耐受特征是指受體對供體異基因外源組織或器官耐受，但對非供體異基因抗原如細菌、病毒等仍保持免疫反應性。

針對免疫耐受，國內外進行了許多探索，涉及諸多領域（包括肝移植、腎移植、心臟移植、皮膚移植等）。Owen（1945）年首次觀察到天然免疫耐受現象，揭示了生物體存在免疫耐受。近年來的研究發現，免疫耐受不但在免疫細胞經過胸腺時發育產生，而且當免疫細胞進入外周后也能產生，這表明機體內存在著胸腺外耐受機制，即不但成年動物發育中的淋巴細胞可以產生免疫耐受，而且成熟的淋巴細胞也可以產生耐受。近年來，嵌合體誘導耐受已經成為免疫研究的熱點，越來越多的實驗證明，通過建立嵌合體狀態能夠誘導穩定的移植耐受。而且有動物實驗證實嵌合的程度越高，越有利于移植物存活。目前誘導免疫耐受大多采取多種措施聯合供體骨髓細胞輸注，使供體骨髓細胞在受體內長期存活，產生混合性嵌合狀態從而誘導免疫耐受。

臨床資料顯示，肝臟移植比其他器官移植更易達到免疫耐受，可能原因是肝臟包含較多的過客白細胞。肝臟位于胃腸道與腔靜脈系統之間，是機體內最大的單核吞噬細胞系統，能吞噬處理大量來自胃腸道和門靜脈的抗原，其獨特的解剖學位置和代謝內環境決定其在免疫調節中發揮重要的作用，而門靜脈穿刺操作復雜，又有許多并發癥發生的危險，使其臨床應用受到制約。

肝細胞表面存在無唾液酸糖蛋白的受體，我們發現經α2-3?Neu預處理的骨髓細胞（bone?marrow?cells?，BMCs）表面則富含無唾液酸糖蛋白。因此，經適當濃度的α2-3?Neu預處理能增強BMCs對肝臟的親和性。我們通過濃度0.2-3U/ml的α2-3?Neu預處理供體骨髓細胞（donor?Bone?Marrow?Cells，dBMCs），經尾靜脈注射，延長了大鼠同種異體皮存活的時間。此種α2-3?Neu在誘導免疫耐受中的應用，其創傷小、易于操作而又安全可靠。

發明內容

本發明的目的就是針對現有的誘導免疫耐受的方法的缺陷，提供一種神經氨酸酶在移植免疫耐受中的應用，具體而言，涉及神經氨酸酶中的一種，即α2-3神經氨酸酶（α2-3Neu）。

肝臟位于胃腸道與腔靜脈系統之間，其獨特的解剖學位置和代謝內環境決定其在免疫調節中發揮重要的作用，而門靜脈穿刺需要為暴露門靜脈而行剖腹手術，操作復雜，有大出血、血管栓塞、門靜脈血栓、肝動脈損傷、膽漏、感染等并發癥發生的危險，還增加皮膚移植等腹外組織器官移植的額外創傷，也使其臨床應用受到制約。

神經氨酸酶多用于流感病毒感染的預防，本發明發現α2-3Neu新的臨床用途。

本發明發現，濃度為0.2-3U/ml的α2-3Neu預處理不影響靜脈輸注后dBMCs在各個器官的分布形式，仍以肝臟內分布最多，胸腺內分布最少；因此經適當濃度的α2-3Neu預處理可使dBMCs靶向分布于受體肝臟內，從而增強其對肝臟的親和性，從而達到經門靜脈注射的效果。

本發明還發現，肝臟對經外周靜脈注入的dBMCs有更強的捕獲能力或者親和性，且dBMCs與受體細胞發生嵌合。在dBMCs輸注后15天后實驗組和對照組受體肝臟內可見造血集落形成，且這些集落呈多細胞系，即異基因細胞注入受體內并沒有被立即清除，而是通過一定的方式移行到受體肝臟內并形成造血集落。濃度為0.2-3U/ml的α2-3Neu預處理組部分受體內可檢測到供體Y染色體的特異片斷，而對照組沒有檢測到。