[發明專利]基于二氧化硅納米粒子作為基因載體的植物轉基因方法

無效

• 申請號: 201110151145.8
• 申請日: 2011-06-08
• 公開（公告）號: CN102260704A
• 公開（公告）日: 2011-11-30
• 發明（設計）人: 付玉芹;王丕武;李魯華;呂長利
• 申請（專利權）人: 吉林農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及二氧化硅納米粒子作為基因載體介導外源基因轉化植物材料并獲得穩定表達的方法，屬于納米生物技術領域。

背景技術

納米技術的出現和發展給生命科學的發展注入了新的活力，隨著納米生物技術在動物和人體醫學領域的應用，納米粒子作為一種新型的基因載體也受到越來越多的關注，但是納米粒子作為基因載體在植物轉基因方面的應用還鮮有報道。目前納米基因載體主要分為三類：無機納米粒子，高分子聚合物以及殼聚糖。二氧化硅納米粒子是一種重要的無機納米粒子，已經被應用于藥物緩釋、基因載體、生物傳感器等生物醫學領域的研究。它能夠很容易以實體球和多孔硅形式被獲得(3-1000nm)。硅納米粒子具有很好的生物相容性，表面容易功能化，常以多聚賴氨酸(poly-l-lysine，PLL)或聚乙烯亞胺等陽離子聚合物等修飾，而且能夠控制攜帶外源基因的數量，被認為是最有前景的基因載體。與高分子聚合物和殼聚糖等納米基因載體相比，作為植物基因載體具有其獨特優越性，通過基因槍與超聲波等方法介導，其轉化材料可以為懸浮細胞、愈傷組織、葉片等器官，特別是當被轉化受體材料為愈傷組織、葉片材料時，很容易分化成苗，獲得轉基因植株。而高分子聚合物以及殼聚糖納米基因載體只能以原生質體和懸浮細胞為材料，轉化后的材料很難再生成植株。因此二氧化硅納米基因載體在植物轉基因中顯示了巨大的應用前景。傳統的以金顆粒為載體的基因槍轉化法，不僅昂貴且容易引起轉基因沉默，而二氧化硅納米粒子不僅價格低廉而且可以通過控制結合的外源基因的數量從而有效地克服基因槍法引起的基因多拷貝效應以及轉基因沉默等缺點；超聲波通過與媒介相互作用產生空化現象，對周圍物質產生剪切作用，從而能夠在細胞壁、細胞膜以至細胞核膜產生瞬時通道，外源DNA可通過此通道進入植物細胞，超聲波轉化法具有成本低、操作簡單、轉化效率高等優點已經得到了廣泛應用，但超聲波處理對DNA造成很大的破壞，而二氧化硅納米粒子能夠有效地保護目的基因免受超聲破壞，從而保證了超聲波法轉化的可行性。納米粒子作為基因載體用于植物的轉基因方法的研究已經有報道(Biotechnol.J.，2008，3，1078-1082；生物技術通報，2009，6：75-80)，但納米粒子介導外源目的基因轉入植物中獲得穩定表達至今還未見報道。實際上，納米粒子的種類選擇以及納米粒子與DNA的結合的比例對于有效提高基因轉導效率并在植物細胞中獲得穩定表達是該技術領域要解決的關鍵問題。

發明內容

本發明的目的之一是提供一種價格低廉且能有效地控制結合DNA的數量，從而相對控制進入植物材料的目的基因的量，進而克服基因槍法缺點的硅納米基因載體，并首次建立了通過基因槍法獲得納米粒子作為基因載體在植物轉基因中的穩定表達方法。本發明的另一目的是提供二氧化硅納米粒子作為基因載體通過超聲波轉化法轉入植物細胞并首次獲得穩定表達植株的轉基因方法。本發明的二氧化硅納米粒子作為基因載體具有生物相容性、容易功能化、攜帶外源基因數量可控等優點，通過基因槍法和超聲波法能夠有效地將外源基因導入植物細胞，可廣泛應用于植物的轉基因領域。本發明的納米粒子作為基因載體進行植物轉化并獲得穩定表達植物的遺傳轉化方法國內外尚未見報道。

本發明的目的之一是通過下述方式實現的：

將不同尺寸(500-1000nm)的二氧化硅納米粒子以多聚賴氨酸(PLL)進行生物學修飾，將修飾后的二氧化硅納米粒子與目的基因進行結合，構建二氧化硅納米粒子-基因復合物，并通過基因槍法轉入植物受體材料。

(1)二氧化硅納米粒子的生物學修飾：取1mg/mL的二氧化硅納米粒子懸浮液與1mg/mL的PLL按質量比為20∶1，10∶1，5∶1的比例進行混合，以使二氧化硅納米粒子功能化，即使二氧化硅納米粒子表面帶上正電荷。通過Z電位儀分析確定合適的修飾比例。

(2)二氧化硅納米粒子-基因復合物的制備：取1mg/m?L的PLL修飾的二氧化硅納米粒子按30∶1，20∶1，10∶1，5∶1的質量比加入目的基因。電泳檢測分析PLL修飾的二氧化硅納米粒子與不同比例目的基因的結合狀況，確定二氧化硅納米粒子與目的基因的結合比例。

(3)通過基因槍法將二氧化硅納米粒子與目的基因的復合物轉入植物受體材料，實現目的基因的導入。即將二氧化硅納米粒子與含有表達β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因的復合物分別轉入雙子葉植物煙草的愈傷組織和葉片中以及單子葉植物玉米的愈傷組織中。