[發(fā)明專利]一種炎癥前期趨化因子拮抗肽及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110150794.6
• 申請(qǐng)日: 2011-06-07
• 公開（公告）號(hào): CN102260324A
• 公開（公告）日: 2011-11-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫晗笑;莫雪梅;李秀英;張光;黃曉泉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 暨南大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K7/08
• 分類號(hào): C07K7/08;C07K1/14;C12N7/01;A61K38/10;A61P29/00
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛(wèi)

1.一種炎癥前期趨化因子拮抗肽，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。

2.表達(dá)權(quán)利要求1所述多肽的噬菌體。

3.一種篩選權(quán)利要求1所述多肽的方法，包括以下步驟：

（1）內(nèi)毒素刺激人外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子，離心收集上清液，分離純化趨化因子；

（2）噬菌體十二肽庫(kù)的親和篩選：以步驟（1）中細(xì)胞上清液作為靶標(biāo)，加入噬菌體十二肽庫(kù)與靶標(biāo)結(jié)合，酸性洗脫液洗脫，篩選出的噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增，此篩選步驟進(jìn)行4輪，第4輪不再擴(kuò)增，直接保存?zhèn)溆茫?/p>

（3）對(duì)步驟（2）所得噬菌體進(jìn)行陽性篩選分析，分別進(jìn)行結(jié)合活性分析、競(jìng)爭(zhēng)抑制分析和趨化因子生成抑制分析，篩選陽性單克隆噬菌體；

（4）陽性單克隆噬菌體DNA的測(cè)序及序列分析，獲得炎癥前期趨化因子拮抗肽。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟（2）所述親和篩選第1輪將LPS加入到無LPS刺激的人外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)上清液，包被過夜后加封閉液封閉，洗滌后加入原始肽庫(kù)溶液，緩慢搖動(dòng)，收集未結(jié)合的噬菌體液；用未結(jié)合的噬菌體液加入到經(jīng)過LPS刺激24h的人外周血單核細(xì)胞上清液中，收集洗脫液進(jìn)行擴(kuò)增；第2輪用第1輪獲得的噬菌體擴(kuò)增液與經(jīng)過LPS刺激24h的人外周血單核細(xì)胞上清液結(jié)合，收集洗脫液擴(kuò)增；第3輪重復(fù)第2輪的步驟，第4輪重復(fù)第3輪的步驟，噬菌體洗脫液保存。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述噬菌體十二肽庫(kù)為美國(guó)New?England?Biolabs公司構(gòu)建的噬菌體隨機(jī)十二肽庫(kù)。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述酸性洗脫液為TBST，且第1輪篩選時(shí)TBST中Tween-20?的濃度為0.1％，第2輪篩選時(shí)TBST中Tween-20?的濃度為0.3％，第3輪篩選時(shí)TBST中Tween-20?的濃度為0.5％。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟（2）中第1輪篩選時(shí)結(jié)合時(shí)間?1h，第2輪篩選時(shí)結(jié)合時(shí)間40min，第3輪篩選時(shí)結(jié)合時(shí)間20min，第4輪篩選時(shí)結(jié)合時(shí)間為10分鐘；4輪洗脫時(shí)間均在10min以內(nèi)。

8.權(quán)利要求1所述炎癥前期趨化因子拮抗肽在制備阻斷炎癥反應(yīng)藥物中的應(yīng)用。