[發明專利]一種甲胺磷人工抗原的制備方法

無效

• 申請號: 201110149802.5
• 申請日: 2011-06-07
• 公開（公告）號: CN102241766A
• 公開（公告）日: 2011-11-16
• 發明（設計）人: 董全;李垚辛;杜小粉;朱開祥
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K14/77;C12N9/08
• 代理公司: 重慶弘旭專利代理有限責任公司 50209
• 代理人: 周韶紅

技術領域

本發明涉及一種甲胺磷人工抗原的制備方法，具體是采用重氮化法將甲胺磷與蛋白質分子偶聯制備甲胺磷人工抗原的方法，屬于免疫技術領域。

背景技術

甲胺磷（Methamidophos，MTP）又名多滅靈，分子式：C₂H₈NO₂PS，分子量：141，化學名稱：O,S-二甲基氨基硫代磷酸酯。甲胺磷作為廣譜高效的有機磷殺蟲劑，曾廣泛用于世界各地，主要用于小麥、水稻、棉花等農作物害蟲的防治。國家農業部和國家發改委下達公告決定從2008年1月1日起停止甲胺磷生產，從根本上杜絕甲胺磷等5種高毒農藥在國內的銷售和使用。但是，這些農藥在全國范圍內仍然時有檢出，已成為果蔬中農藥殘留的主體農藥，由此導致的安全事件依然屢屢發生，對人體健康造成了極大的危害。因此很有必要建立適用于現場檢測的快速、便捷的有機磷農藥殘留檢測方法。

目前對甲胺磷的檢測方法主要有氣相色譜(gas?chromatography，GC)、薄層色譜(thin?layer?chromatography，TLC)、高效液相色譜(high?performance?liquid?chromatography，HPLC)等。這些方法大多需要對被分析樣品進行前處理，且操作復雜，不能滿足現場快速檢測的要求。開發特異性強、靈敏度高、方便快捷、安全廉價的新分析技術極為迫切。

甲胺磷分子量141，屬于小分子物質，不具備免疫原性。必需與載體蛋白偶聯合成人工完全抗原才能進一步用于制備多克隆抗體。

國家專利局2003年7月公開的申請號為03114895.6的專利涉及一種適用于甲胺磷殘留分析的酶聯免疫吸附測定試劑盒，對盒內試劑及測定方法進行了說明，但未涉及甲胺磷人工抗原的制備方法。

國家專利局于2001年12月公開的申請號為01114706.7的專利涉及一種甲胺磷人工抗原的制備，是將甲胺磷的前體產物O,S-二甲基硫化磷酰氯與蛋白質上的氨基基團直接偶聯而獲得人工抗原。2005年12月公開的申請號為200510126412.0的專利也涉及一種甲胺磷半抗原、人工抗原及其制備方法，以O,S-二甲基硫化磷酰氯為前體合成甲胺磷的結構衍生物（半抗原）該衍生物在保留甲胺磷結構的基礎上引入橋結構和用于偶聯大分子的活性基團。但該發明制備人工抗原步驟較繁瑣。

發明內容

本發明的目的在于提供一種甲胺磷人工抗原的制備方法，為以后篩選出它的特異性抗體和建立免疫分析方法奠定基礎。

本發明選用重氮化法，在弱酸環境下，利用亞硝酸鹽先將甲胺磷分子上的氨基轉化為重氮基團，再在堿性環境中利用重氮基團與蛋白質上的羧基反應將甲胺磷小分子與蛋白質分子偶聯。在重氮鍵合成時，保持微酸環境，重氮溶液加入到蛋白質溶液中，緩慢連續攪拌可以使其反應充分，增加偶聯物的結合比。

本發明依次通過以下步驟實現：

（1）將牛血清白蛋白BSA溶于pH9.0的硼酸鹽緩沖液中，使BSA濃度達到0.01～0.03g/mL；

（2）將甲胺磷溶于0.01mol/L的HCl溶液中，使甲胺磷濃度達到0.01～0.05g/mL，冰浴，邊攪拌邊緩慢加入預冷的0.1mol/L亞硝酸鈉溶液，直至淀粉碘化鉀試紙變藍，繼續攪拌反應30～60min；

（3）將步驟（2）溶液緩慢加入到步驟（1）溶液中，使牛血清白蛋白與甲胺磷的摩爾比為1:500～1000，冰浴攪拌2h，4℃反應24h后，置于pH7.4的磷酸鹽緩沖液中透析3～5d，每12h換一次透析液；最后冷凍干燥，即得到合成的甲胺磷人工抗原。

上述方法中，蛋白質是牛血清白蛋白（BSA），也可以用卵清蛋白（OVA）或辣根過氧化酶（HRP）代替。

本發明的優點是采用重氮化法，操作簡便，試劑價廉，比一般方法節省成本15％，并且一步完成反應，人工抗原制備的效率提高3％～5％。

具體實施方式

實例1：

取100mgBSA溶于10mL?pH9.0的硼酸鹽緩沖液中；