[發(fā)明專利]VKORC1基因的第-1639位堿基的多態(tài)性檢測(cè)方法、以及用于該方法的核酸探針和試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110147103.7
• 申請(qǐng)日: 2011-06-01
• 公開（公告）號(hào): CN102268476A
• 公開（公告）日: 2011-12-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 小森真理子
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 愛科來(lái)株式會(huì)社
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 中原信達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11219
• 代理人: 楊青;樊衛(wèi)民

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及VKORC1基因的第-1639位堿基的多態(tài)性檢測(cè)方法、以及用于該方法的核酸探針和試劑盒。

背景技術(shù)

對(duì)于心肌梗塞、腦梗塞患者，廣泛使用華法林(warfarin)作為防止血液凝固的藥物。華法林的適用量根據(jù)人種而有大的差異，進(jìn)而，即便是相同人種，個(gè)體間也顯示出差異。若過(guò)量投與華法林，則有可能發(fā)生例如鼻出血、皮膚內(nèi)出血，或者有時(shí)還會(huì)發(fā)生顱內(nèi)出血等副作用。因此，在治療中對(duì)各個(gè)患者分別確定華法林的適當(dāng)用量變得極為重要。

在確定這樣的華法林的適用量值之際，近年來(lái)，有報(bào)道稱：CYP2C9基因和VKORC1基因的多態(tài)性關(guān)系到華法林的藥效(非專利文獻(xiàn)1、2)。CYP2C9基因是編碼用于制備華法林代謝酶的細(xì)胞色素P450的基因。VKORC1基因是編碼作用于維生素K的蛋白質(zhì)的基因，該維生素K參與血液的凝固。因此，檢測(cè)出這兩種基因的多態(tài)性對(duì)于相應(yīng)于患者來(lái)確定華法林的適用量、并減少副作用而言也是非常重要的。另外，作為VKORC1基因的多態(tài)性，已知1173C＞T(rs9934438)、-1639G＞A(rs9923231)等。這些VKORC1基因的多態(tài)性記載于非專利文獻(xiàn)3～5中。

作為檢測(cè)堿基的多態(tài)性的方法，有PCR-RFLP法(聚合酶鏈-限制性長(zhǎng)度多態(tài)性分析)(非專利文獻(xiàn)3)或利用焦磷酸測(cè)序(pyrosequencing)技術(shù)來(lái)檢測(cè)突變的方法(非專利文獻(xiàn)4)。

然而，非專利文獻(xiàn)3的PCR-RFLP法需要花費(fèi)功夫和成本，例如在進(jìn)行DNA的提取純化和PCR后，需要對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制酶處理、進(jìn)行電泳等。另外，由于在進(jìn)行PCR后需要進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的處理，因此有擴(kuò)增產(chǎn)物混入下一反應(yīng)體系之虞，存在難以自動(dòng)化、無(wú)法同時(shí)檢測(cè)多個(gè)核酸序列的問(wèn)題。

非專利文獻(xiàn)4的焦磷酸測(cè)序是基于如下原理的，即，通過(guò)將核苷酸被引入DNA時(shí)所釋放的焦磷酸轉(zhuǎn)變成ATP來(lái)用于發(fā)光反應(yīng)，從而能夠定量有多少核苷酸被引入DNA中。實(shí)際上，是通過(guò)每次加入一種脫氧核糖核苷酸測(cè)定發(fā)光量后將之除去并重復(fù)進(jìn)行這種操作，從而確定序列的。作為除去過(guò)剩核苷酸的方法，有固相化法，其將模板DNA結(jié)合到某些固相基質(zhì)上，通過(guò)用反應(yīng)液沖洗來(lái)除去過(guò)剩核苷酸；和液相法，其通過(guò)加入腺苷三磷酸雙磷酶(apyrase)來(lái)分解核苷酸。雖然有自動(dòng)進(jìn)行這些繁雜作業(yè)的系統(tǒng)在售，但價(jià)格非常昂貴，需要成本。另外，存在必須進(jìn)行DNA的提取純化、前處理等，需要花費(fèi)功夫和成本的問(wèn)題。

另一方面，已知有：通過(guò)PCR(聚合酶鏈反應(yīng))對(duì)包含突變的區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增后，使用熒光染料標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行融解曲線分析，并基于融解曲線分析的結(jié)果來(lái)解析突變的方法(專利文獻(xiàn)1、2)。然而，在這些文獻(xiàn)中，關(guān)于探針的設(shè)計(jì)僅有如下教導(dǎo)，即，應(yīng)將探針設(shè)計(jì)成：當(dāng)使末端部被熒光染料記的淬滅探針與目標(biāo)核酸雜交時(shí)，在末端部，探針-核酸雜交體的多個(gè)堿基對(duì)至少形成一個(gè)G-C對(duì)(pair)。

專利文獻(xiàn)3中記載有，使用5’末端熒光標(biāo)記的探針，通過(guò)融解曲線分析來(lái)同時(shí)檢測(cè)VKORC1?1173C＞T(rs9934438)和CYP2C9*3的方法。但是，并沒有記載檢測(cè)VKORC1-1639G＞A(rs9923231)的多態(tài)性的方法。另外，也沒有記載同時(shí)檢測(cè)VKORC1-1639G＞A(rs9923231)的多態(tài)性和CYP2C9*3突變位點(diǎn)的多態(tài)性的方法。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)：

專利文獻(xiàn)：

專利文獻(xiàn)1：日本特開2001-286300號(hào)公報(bào)

專利文獻(xiàn)2：日本特開2002-119291號(hào)公報(bào)

專利文獻(xiàn)3：國(guó)際公開公報(bào)WO/2008/117782

非專利文獻(xiàn)1：Simone?Rost?et?al.，Nature?Vol.427?2004letters?to?nature

非專利文獻(xiàn)2：Mark?J.Rieder?et?al.，The?New?England?Journal?of?Medicine?352；22，2005

非專利文獻(xiàn)3：TDM研究Vol.25?No.4(2008)141-144

非專利文獻(xiàn)4：BLOOD，1?SEPTEMBER?2007?VOLUME?110，NUMBER?5

非專利文獻(xiàn)5：Genet?Med.2008?Feb；10(2)：89-98

發(fā)明內(nèi)容。

發(fā)明要解決的問(wèn)題