[發(fā)明專利]一種核苷酸序列、基于序列編碼的融合蛋白、制備的結(jié)核分枝桿菌疫苗及其制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110147055.1
• 申請(qǐng)日: 2011-06-02
• 公開（公告）號(hào): CN102604979A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 余銘恩;胡成平;馮俊濤;吳瓊杉;李曉照
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州賢至生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/62
• 分類號(hào): C12N15/62;C07K19/00;A61K48/00;A61K39/04;A61P31/06;C12N15/85;C12N15/861;C12R1/32
• 代理公司: 杭州中平專利事務(wù)所有限公司 33202
• 代理人: 翟中平

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地是涉及一種新的核苷酸序列，該核苷酸所編碼的蛋白包含結(jié)核分枝桿菌ESAT6蛋白和Ag85B蛋白的優(yōu)勢(shì)抗原表位，還涉及該核苷酸序列在制備結(jié)核分枝桿菌疫苗上的應(yīng)用。?

背景技術(shù)：

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium?tuberculosis，MTB)是引起結(jié)核病的病原微生物，廣泛分布于世界各地。據(jù)估計(jì)，全球每年有800萬(wàn)新感染的結(jié)核患者，有200萬(wàn)人死亡。另外，據(jù)衛(wèi)生部調(diào)查，我國(guó)目前有近半數(shù)人口(5.5億)感染過(guò)結(jié)核菌，每年約有145萬(wàn)新發(fā)病例，并且每年因結(jié)核病死亡人數(shù)達(dá)13萬(wàn)，大大超過(guò)其它傳染病死亡人數(shù)的總和。?

卡介苗做為目前臨床上唯一使用的抗結(jié)核疫苗，迄今已使用了近100年。但在長(zhǎng)期的使用中發(fā)現(xiàn)，卡介苗免疫保護(hù)作用差異很大(0％～80％)，預(yù)防成人結(jié)核病方面根本就沒有效果。除此之外，卡介苗尚存在下述缺點(diǎn)：卡介苗是全菌疫苗，可引起淋巴結(jié)腫大和化膿等異常反應(yīng)；卡介苗接種干擾了純蛋白衍生物(purified?protein?dervatives，PPD)診斷結(jié)核感染的價(jià)值；卡介苗接種免疫缺陷病人可引起全身播散性致死感染以及卡介苗誘導(dǎo)的保護(hù)力隨時(shí)間推移而降低，因此，尋找一種比卡介苗免疫保護(hù)作用更好的結(jié)核分枝桿菌疫苗迫在眉睫。?

研究發(fā)現(xiàn)，ESAT6(6kD?early?secretory?antigenic?target)是結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)早期分泌的相對(duì)分子質(zhì)量為6×10³的蛋白，具有較強(qiáng)的細(xì)胞免疫活性，其可導(dǎo)致再感染結(jié)核分枝桿菌小鼠的記憶性免疫CD4⁺T細(xì)胞增殖及γ干擾素大量產(chǎn)生，而γ干擾素可?顯著活化巨噬細(xì)胞，提高巨噬細(xì)胞對(duì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)抑制作用和殺傷能力，因此ESAT6蛋白可作為結(jié)核亞單位疫苗的有效成分(Brandt?et?al，2000)。Ag85則是結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)早期濾液中的一種分泌蛋白，具有分枝菌酸轉(zhuǎn)移酶的活性，在細(xì)菌細(xì)胞壁合成晚期起關(guān)鍵作用，并且可與細(xì)胞表面纖連蛋白結(jié)合，在分枝菌粘附細(xì)胞的過(guò)程中起重要作用。Ag85含有三種成份，分別是Ag85A、Ag85B和Ag85C。Silver等人(1995)發(fā)現(xiàn)Ag85B可刺激純蛋白衍生物實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性的健康人群外周血單核細(xì)胞(peripheral?blood?mononuclear?cells，PBMC)明顯增殖并產(chǎn)生γ干擾素。因此，Ag85B蛋白也是一種制備結(jié)核疫苗的候選有效組成成分。?

迄今為止，有關(guān)于ESAT6基因和Ag85B基因的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究表明，利用天然結(jié)核分枝桿菌ESAT6基因和Ag85B基因構(gòu)建的結(jié)核分枝桿菌疫苗免疫BALB/c小鼠能產(chǎn)生一定水平的體液免疫和細(xì)胞免疫，但普遍存在免疫水平較低、保護(hù)力不夠等問題，究其原因可能是由于不同生物的密碼子偏愛性不同，導(dǎo)致ESAT6天然基因和Ag85B天然基因在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的蛋白表達(dá)困難而造成免疫效果不佳。?

本發(fā)明選擇采用人偏愛密碼子優(yōu)化結(jié)核分枝桿菌ESAT6蛋白和Ag85B蛋白優(yōu)勢(shì)抗原表位所對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，以提升其表達(dá)量，進(jìn)而提高其免疫原性。?

發(fā)明內(nèi)容：

發(fā)明專利目的：?

本發(fā)明的目的之一在于提供一種新的核苷酸序列，該核苷酸所編碼的蛋白包含結(jié)核分枝桿菌ESAT6蛋白和Ag85B蛋白的優(yōu)勢(shì)抗原表位。?

本發(fā)明的另一目的在于該核苷酸序列在結(jié)核分枝桿菌疫苗上的應(yīng)用，并分別制備結(jié)核分枝桿菌DNA疫苗pcDNA3.1(+)-EA和重組腺病毒疫苗pAd-EA。?

發(fā)明技術(shù)方案：?

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，發(fā)明人(1)分析選擇結(jié)核分枝桿菌ESAT6蛋白和Ag85B?蛋白的優(yōu)勢(shì)抗原表位，將兩者連接形成新的融合蛋白EA。(2)采用人偏愛密碼子將融合蛋白EA的氨基酸序列轉(zhuǎn)換成核苷酸序列并合成。(3)將合成后的融合蛋白EA基因分別克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)及腺病毒載體pAd。(4)將構(gòu)建的pcDNA3.1(+)-EA作為DNA疫苗免疫BALB/c小鼠。(5)將構(gòu)建的pAd-EA重組腺病毒疫苗免疫BALB/c小鼠。(6)通過(guò)間接ELISA實(shí)驗(yàn)及淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其免疫效果。?

本發(fā)明在分析選擇結(jié)核分枝桿菌ESAT6蛋白和Ag85B蛋白優(yōu)勢(shì)抗原表位的基礎(chǔ)上，以人偏愛密碼子為依據(jù)，設(shè)計(jì)了一種全新的核甘酸序列，并證實(shí)該核苷酸序列所表達(dá)的融合蛋白在BALB/c小鼠體內(nèi)具有優(yōu)良的免疫原性，從而為開發(fā)結(jié)核分枝桿菌疫苗提供了一種新的核苷酸序列和思路。?

有益效果：?