[發明專利]一種甘薯胚性愈傷長期增殖保存的方法

無效

• 申請號: 201110146697.X
• 申請日: 2011-05-24
• 公開（公告）號: CN102217546A
• 公開（公告）日: 2011-10-19
• 發明（設計）人: 王欣;李強;馬代夫;李秀英;謝逸萍
• 申請（專利權）人: 江蘇徐州甘薯研究中心
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 徐州市三聯專利事務所 32220
• 代理人: 周愛芳

技術領域

本發明涉及一種植物組織培養方法，具體涉及一種甘薯胚性愈傷組織通過植物組織培養和顯微監控技術達到增殖和長期繼代保存的方法。

背景技術

甘薯(Ipomoea?batatas(L.)Lam.)是世界上重要的糧食、飼料、工業原料和新型能源作物，在亞洲、非洲和拉丁美洲等熱帶、亞熱帶、溫帶地區廣為栽培。甘薯在世界糧食生產中，總產排列第7位。在我國糧食生產中，僅次于水稻、小麥和玉米，居第4位，具有重要的經濟價值和戰略地位。目前我國甘薯常年種植面積在5-6×10⁶hm²，占世界總面積的60％以上，年總產量占世界總產量的80％以上。

由于甘薯遺傳上的高度雜合性和種間、種內廣泛存在的雜交不親和性，限制了其育種中親本的自由選配。加之，甘薯遺傳資源匱乏，遺傳基礎狹窄，優異近緣野生種利用困難和病蟲、病毒病危害嚴重，極大地制約了甘薯的生產和發展。利用植物基因工程技術能有效克服常規育種中存在的物種隔離和基因連鎖等障礙，對甘薯品種選育和生產無疑具有潛在的推動意義。甘薯的遺傳轉化研究起步較晚，雖然取得了一些進展，但仍存在著受體材料制備困難，嵌合體和轉化效率低等問題，缺乏一個高效的遺傳轉化體系，因而限制了甘薯基因工程的發展。

甘薯胚性愈傷組織可以由體細胞胚胎發生途徑再生植株，是甘薯轉基因利用的主要受體材料。劉慶昌(1996)在生物技術學報發表文章對甘薯胚性懸浮培養的研究表明：28周內懸浮培養甘薯品種栗子香可保持100％植株再生能力，37周即降為45.8％。目前甘薯胚性愈傷組織培養中存在的主要問題是：(1)利用目前的胚型愈傷懸浮液體增殖技術，甘薯胚性愈傷的胚性保持時間短。(2)胚性愈傷與非胚性愈傷共存，易被增值能力快的非胚型愈傷競爭而失去生存能力和空間，喪失再生能力。(3)胚性愈傷易分化形成胚狀體，失去增殖能力，喪失胚性。(4)外植體取材受甘薯生育期限制，需每年在春季進行莖尖誘導制備胚性愈傷，生產成本高，胚性愈傷擴繁數量少，無法滿足高效遺傳轉化體系受體材料長期提供的需要。針對以上問題，本發明開發一種甘薯胚性愈傷長期繼代增殖的組培方法，為組培苗生產和轉基因實驗長期提供材料。

發明內容

本發明的目的是提供一種甘薯胚性愈傷長期繼代增殖的組培方法，它是利用莖尖分生組織培養過程中誘導形成的胚性愈傷進行形態篩選繼代，達到長期保存和擴增胚性愈傷，以用于生產和實驗的方法。

本發明所設計的甘薯胚性愈傷長期繼代增殖方法通過以下技術方案實現，具體如下：

(1)、繼代胚性愈傷的選擇處理：在莖尖分生組織脫分化誘導出愈傷后，在體視鏡下篩選可保持胚性的結構致密、近球形的胚性愈傷，剔除魚雷胚、子葉胚和結構松散的非胚性愈傷，移入含有1-3mg/L?2，4-D的MS固體培養基中培養，所用培養基體積為25mL，培養皿直徑直徑為9cm，每培養皿放置20-30塊直徑2-3mm的胚性愈傷，培養條件為22±1℃，黑暗；

(2)、胚性愈傷的繼代增殖過程：按步驟(1)培養每45天后，胚性愈傷長至5-8mm，在體視鏡下剔除魚雷胚、子葉胚和非胚性愈傷，選擇顆粒致密的心形和球形胚性愈傷部分，用尖頭鑷子夾取并按照步驟(1)所述方法培養，1塊愈傷可切取為2-3塊，實現幾何級數增長，3年后理論上可增至2²⁴-3²⁴個保持胚性的胚性愈傷；

(3)、胚性愈傷經體細胞胚胎發生途徑再生：將按照步驟(2)增殖的胚性愈傷組織轉移到含1.0mg/L?ABA的MS固體培養基中，28±1℃，每日13h，3000Lx光照下培養3-4周，體細胞胚發育并成小植株，再將獲得的小植株轉移到MS固體培養基中，在28±1℃，每日13h，3000Lx光照下培養3-4周，即可獲得完整植株。

本發明的優點：

1)胚誘導率低是甘薯組培中存在的主要問題，也是制約甘薯轉基因、體細胞植株工廠化生產的瓶頸，通過胚性愈傷繼代增殖，可大量提供轉基因受體材料，解決胚誘導率低的問題。

2)以往利用胚性懸浮系增殖方式，增殖速度快，雖短時間可獲得大量胚性愈傷，但因其繼代頻繁，胚性愈傷在繼代10次后，出現愈傷老化，胚性喪失，再生率下降等問題，使得此方法獲得的胚性愈傷只能使用6個月；又因其幾何增殖，大量愈傷獲得時間集中，加大了遺傳轉化的工作量；經常剝取莖尖誘導胚性愈傷，費工、費錢，還受生育期及氣候等自然條件的極大限制；由于缺乏長期足量的胚性愈傷作為受體材料而影響了轉基因工作的進程。本發明方法可以彌補以上不足，長期保存胚性愈傷，實現轉基因材料的長期大量提供。