[發(fā)明專利]基于Livin的免疫刺激復合物及其制備方法和應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110145897.3
• 申請日: 2011-06-01
• 公開（公告）號: CN102210862A
• 公開（公告）日: 2011-10-12
• 發(fā)明（設計）人: 陳宏頡;王守森;鄭兆聰;袁邦青;王如密;高進喜;趙琳
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍南京軍區(qū)福州總醫(yī)院
• 主分類號: A61K39/39
• 分類號: A61K39/39;A61K39/00;C12N15/79;A61P35/00
• 代理公司: 北京同恒源知識產(chǎn)權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發(fā)明屬于基因工程技術領域，涉及一種免疫刺激復合物（immunostimulating?complex,?ISCOM），特別涉及一種基于Livin的免疫刺激復合物，還涉及該免疫刺激復合物的制備方法及其在制藥領域的應用。

背景技術

神經(jīng)膠質瘤是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，因其呈浸潤性無限制增生、與正常組織無明顯界限并富含血管，而具有高復發(fā)率和低治愈率，死亡率和致殘率均很高。尋找新的有效治療藥物和方法以徹底攻克神經(jīng)膠質瘤，一直是世界醫(yī)學領域的主要課題之一。近年來，免疫學的不斷發(fā)展為神經(jīng)膠質瘤的治療帶來了新的手段和方法，免疫治療已被視為繼手術、放療、化療之后的第四種治療模式。

CD8⁺?T細胞是機體免疫系統(tǒng)的主要組成部分，在針對病毒、細菌、真菌等病原性微生物以及惡性腫瘤等的免疫監(jiān)視、免疫防御以及免疫治療過程中發(fā)揮關鍵性作用。長期以來，中樞神經(jīng)系統(tǒng)被認為是一個免疫特免區(qū)，然而中樞神經(jīng)系統(tǒng)并非“免疫特赦器官”，其可以發(fā)生免疫反應，只是存在復雜的免疫反應條件。神經(jīng)膠質瘤能夠在機體內(nèi)存在并逃逸免疫監(jiān)視的主要原因在于：（1）神經(jīng)膠質瘤細胞免疫原性弱；（2）神經(jīng)膠質瘤細胞分泌大量的免疫抑制因子；（3）神經(jīng)膠質瘤細胞存在主要組織相容性復合體（MHC）和共刺激分子B7的表達障礙。因此，誘導神經(jīng)膠質瘤免疫的關鍵是將神經(jīng)膠質瘤抗原有效呈遞給效應細胞。

樹突狀細胞（DC）是體內(nèi)最強大的專職抗原遞呈細胞，能夠識別、捕獲、加工、遞呈抗原引發(fā)初始免疫反應，可分泌極化信號誘導Th0細胞向Th1細胞分化，還可通過“交叉激活”途徑激活CD8⁺?T細胞。利用樹突狀細胞來改善抗原的免疫原性是治療性疫苗設計的重要策略之一。

細胞凋亡是由多因子介導的細胞主動死亡過程。腫瘤的形成和發(fā)展與細胞凋亡異常密切相關。Livin是近年來發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白（IAPs）家族的重要成員。Livin基因位于人染色體20q13.3，全長4.6kb，包括7個外顯子和6個內(nèi)含子。Livin的N端包含一個串聯(lián)的含有半胱氨酸/組氨酸的保守BIR（桿狀病毒IAP重復序列）結構域，該結構域是參與抑制細胞凋亡作用的主要部位；C端包含一個環(huán)指結構域（RING結構域），該結構域不參與抑制細胞凋亡作用，但對Livin在細胞內(nèi)的合理分布具有重要作用。研究顯示，Livin能夠抑制多種刺激劑包括病毒、感染、化學治療藥物、癌基因抑活藥、生長因子撤除、TNF-a/Fas凋亡信號途徑等觸發(fā)的細胞凋亡，與神經(jīng)膠質瘤的發(fā)生、發(fā)展及耐藥密切相關。

免疫球蛋白G（IgG）Fc段是抗體恒定區(qū)重要的結構域，是抗體分子與效應分子和細胞相互作用的部位。Fc段不僅能激活補體系統(tǒng)，而且能介導抗原抗體復合物通過Fc受體與抗原呈遞細胞結合，并在受體的介導下促進抗原呈遞細胞對外來抗原的吞噬，進而激發(fā)機體對特定抗原的細胞免疫反應。研究證明，在抗原呈遞細胞中，通過Fc受體介導內(nèi)吞的外來抗原，不僅可以大幅度促進MHCⅡ途徑呈遞抗原的活性而激活CD4+?T細胞，而且可以通過MHCⅠ交叉呈遞抗原作用激活CD8+?T細胞。

免疫刺激復合物是由抗原、皂苷Quil?A、膽固醇及磷脂混合后自發(fā)形成的一種直徑為30~40nm的球形籠狀顆粒，具有免疫佐劑和抗原遞呈的雙重功能，可以大幅度提高抗原的免疫原性。文獻報道，以免疫刺激復合物形式制得的DNA疫苗誘導的中和抗體水平和免疫保護力明顯高于裸DNA，可能的機制是經(jīng)免疫刺激復合物包裹的DNA能夠免受體內(nèi)核酸酶的降解，從而保證該DNA在機體內(nèi)持續(xù)表達。另外，免疫刺激復合物的結構特性使其更易于定居在淋巴組織內(nèi)，從而有利于抗原遞呈細胞的吞噬。

近年來研究還發(fā)現(xiàn)，普遍存在于細菌DNA中的含胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤（CpG）基序的寡脫氧核苷酸（CpG?ODN）具有特殊的免疫刺激效應，人工合成的含CpG基序的CpG?ODN也具備相似的免疫調節(jié)特性，與蛋白類抗原聯(lián)合應用可有效地誘導機體產(chǎn)生免疫應答，具有潛在的免疫佐劑效應。

但迄今為止，國內(nèi)外尚未見涉及Livin基因、IgG?Fc段基因以及CpG基序的免疫刺激復合物的相關報道。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種基于Livin的免疫刺激復合物，可以大幅度提高Livin的免疫原性，促進抗原遞呈細胞對其的吞噬，進而高效誘導Livin特異性的T細胞免疫應答。

為達到上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：

基于Livin的免疫刺激復合物，由Livin和IgG?Fc段雙基因共表達重組真核載體、CpG基序、皂苷Quil?A、膽固醇和卵磷脂組成。