[發明專利]原發性開角型青光眼致病基因動物模型及其構建方法

無效

• 申請號: 201110143751.5
• 申請日: 2011-05-31
• 公開（公告）號: CN102229959A
• 公開（公告）日: 2011-11-02
• 發明（設計）人: 原慧萍;邵正波;沈婧
• 申請（專利權）人: 哈爾濱醫科大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A01K67/027
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;余光軍

技術領域

本發明涉及一種表達致病基因的動物模型，尤其涉及一種在小鼠視網膜特異表達人突變型OPTN(E50K)基因原發性的開角型青光眼動物模型及其構建方法，屬于動物模型的構建領域。

背景技術

OPTN基因是原發性開角型青光眼(Primary?open?angle?glaucoma，POAG)致病基因之一，OPTN基因E50K突變可以導致視網膜神經節細胞(Retinal?ganglial?cells，RGCs)的凋亡，但機制不清

Chi?ZL等(Overexpression?of?optineurin?E50K?disrupts?Rab8interaction?and?leads?to?a?progressive?retinal?degeneration?in?mice.Chi?ZL，Akahori?M，Obazawa?M，et?al.Hum?Mol?Genet.2010；19(13)：2606-15)公開了一種原發性開角型青光眼的動物模型，其所應用的OPTN(E50K)小鼠轉基因基因模型的突變基因均為小鼠源性，由于小鼠的OPTN基因與人類的OPTN基因并不完全相同，這就限制了此類轉基因模型在人類原發性開角型青光眼發病機制以及治療研究中的應用；

Kroeber?M等(Transgenic?studies?on?the?role?of?optineurin?in?the?mouse?eye.Kroeber?M，Ohlmann?A，Russell?P，et?al.Exp?Eye?Res.2006；82(6)：1075-85)公開的是一種βB1-crystallin-OPTN轉基因小鼠模型，即利用雞晶體蛋白βB1分別建立OPTN轉基因小鼠和轉化生長因子TGF-β1轉基因小鼠，證實OPTN蛋白是一種細胞質蛋白。進一步對OPTN-TGF-β1雙轉基因小鼠研究發現OPTN蛋白不能對抗TGF-β1誘導的晶體上皮凋亡過程，表明OPTN蛋白可能不參與TGF-β1基因調控路徑，但此研究的重點不是青光眼，而且并未對OPTN(E50K)突變模型進行制作和研究。

小鼠在細胞和組織器官的生理結構、功能特征以及眾多生化途徑與人類相似；在一定程度上能夠控制外界因素對表型的影響；小鼠同時擁有眾多的近交系，可迅速繁殖，人們可在相對均一的遺傳背景下分析轉入目的基因的功能。利用轉基因手段建立原發性開角型青光眼致病基因小鼠模型，有助于系統地研究人類OPTN(E50K)突變致POAG的發病機制及發生發展趨勢。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是克服現有的原發性開角型青光眼致病基因動物模型的構建中所存在的不足，提供一種新的原發性開角型青光眼致病基因動物模型及其構建方法。本發明鑒于鼠源的OPTN(E50K)基因與人類基因的不同，將人的OPTN(E50K)引入視網膜特異啟動子，利用轉基因技術，使小鼠的視網膜特異表達人的OPTN(E50K)基因，建立了OPTN(E50K)突變致原發性開角型青光眼的模型，為系統地研究人類OPTN(E50K)突變致POAG的發病機制、發生發展趨勢、疾病的轉歸以及治療開辟了新的道路，提供了研究動物。

本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的：

一種原發性開角型青光眼致病基因動物模型，其構建方法包括以下步驟：

1、將人OPTN(E50K)突變基因克隆到帶有視網膜啟動子c-kit的表達載體中，構建得到重組哺乳動物表達載體；

2、將所構建的重組哺乳動物表達載體導入到小鼠體內，篩選鑒定獲得轉基因小鼠，即得。

其中，所述的人OPTN(E50K)突變基因是將OPTN的ORF區148位G突變為A；所述的視網膜啟動子c-kit是小鼠視網膜啟動子c-kit；所述的表達載體是pcDNA3.0。

本發明的一個優選的整體技術方案的詳述：

1、pcDNA3-C-Kit-OPTN(E50K)轉基因載體質粒構建

(1)將視網膜啟動子c-kit插入到表達載體；

(2)將OPTN(E50K)突變基因克隆到帶有c-kit的表達載體，獲得pcDNA3-C-Kit-OPTN(E50K)表達質粒

2、小鼠受精卵品系：C57*CBA?F?1小鼠

3、轉基因小鼠制備方式：小鼠受精卵細胞雄原核DNA顯微注射，將注射卵分別移植到假孕母鼠的輸卵管中，將出生小鼠經基因組DNA的PCR檢測，獲得轉基因陽性小鼠，稱作Founder，即首建鼠。