[發明專利]一種檢測流產鸚鵡熱衣原體的試劑盒及方法

無效

• 申請號: 201110143186.2
• 申請日: 2011-05-20
• 公開（公告）號: CN102787162A
• 公開（公告）日: 2012-11-21
• 發明（設計）人: 藺國珍;邱昌慶;鄭福英;周繼章;曹小安;宮曉煒
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司 62102
• 代理人: 張晉

技術領域

本發明涉及一種檢測微生物的試劑盒，特別是一種對豬、羊和牛進行流產鸚鵡熱衣原體檢測的試劑盒以及其制備和使用方法。

背景技術

衣原體(Chiamydiaceae)是一類介于細菌和病毒之間專性細胞內寄生的革蘭氏陰性微生物，大小為0.2～0.4μm。鸚鵡熱衣原體(C.psittaci)作為衣原體屬中十分重要的一個種，是動物衣原體病的主要致病菌，具有廣泛的宿主，家畜中以牛、羊、豬較為易感。可造成由胎兒夭折、產奶量大幅減少以及飼料、人力浪費而引起的巨大經濟損失，給養殖業造成了重大危害。此外，流產鸚鵡熱衣原體還可以感染人，威脅人類健康。

動物衣原體病的研究始于19世紀末，Marange(1892)在阿根廷首都布宜諾斯艾利斯發現，與鸚鵡鳥接觸的人會突然發病，從而最終肯定了鸚鵡鳥在人類感染和罹病中的重要作用，并提出了鸚鵡熱(Psittacosis)這一新病名。目前本病已遍及世界大多數國家和地區。衣原體可以引起哺乳動物的流產、肺炎、腸炎、腦脊髓炎、多漿膜炎、多關節炎、角膜結膜炎、尿道炎及雞的輸卵管炎等。根據對北京市郊區畜禽流行病學調查發現，一些養殖場都不同程度查出了衣原體病原，引起了種豬鸚鵡熱衣原體性流產和肺炎，甚至在進口的種山羊中也存在鸚鵡熱衣原體。2001年，蘭州獸醫研究所對采自廣西、安徽和江蘇12個縣的343份水牛血清IHAT檢測，發現各縣水牛群均不同程度存在衣原體感染，陽性檢出率最低為3.3％，最高為39.3％。由于動物衣原體病感染初期多表現不明顯，和其他許多病癥有相似性，因此易于混淆。

目前我國對動物衣原體病的檢測方法主要應用生物培養和血清學試驗(《畜禽衣原體病及其防治》，邱昌慶主編)。生物培養雖然準確可靠，但耗時長，操作復雜，無法進行大規模檢測；血清學方法中IHA和免疫層析試紙法雖然簡便易操作，但和ELISA檢測方法一樣都無法分辨動物衣原體自然感染還是免疫狀態，還存在著一定的交叉反應和人為誤差隱患，此外，ELISA檢測還需要酶標儀等專門的儀器。這些都給臨床檢疫帶來了極大困難。碘和Giemsa染色法也是本病檢測常用的方法之一，參見《畜禽衣原體病及其防治》(邱昌慶主編)，但這種方法不適合直接用于臨床樣本的檢測。隨著分子生物學的發展，普通PCR方法(周繼章等，2007)因其敏感、快速、無需活菌操作等優點，已經大量用于本病原檢測，但需要專門的儀器、操作繁瑣，不適合臨床及基層生產使用。依賴核酸序列的擴增技術(NASBA)雖然更加簡便、快速、特異，并已用于多種病毒的檢測，但應用NASBA在對一些病原的檢測中存在靈敏度不夠和假陽性等問題(高閃電等，2009)。因此，隨著鸚鵡熱衣原體引起的人畜共患病日趨嚴重，建立高效、快速、準確并適合基層生產的牛、羊、豬等流產鸚鵡熱衣原體檢測方法越來越迫切。

發明內容

本發明提供一種可克服現有技術不足，便于在基層應用，檢測耗時短，成本低，操作簡單方便的檢測牛、羊、豬流產鸚鵡熱衣原體的試劑盒，以及這種試劑盒的制備方法和使用方法。

本發明的檢測流產鸚鵡熱衣原體的試劑盒中包括有由外引物和內引物組成的兩對特異性引物，其中：上游外引物F3的序列為SEQ?ID?№1；下游外引物B3的序列為SEQ?ID?№2；上游內引物FIP的序列為SEQ?ID?№3；下游內引物BIP的序列為SEQ?ID?№4。

為方便使用，試劑盒中還可放置甜菜堿、硫酸鎂、dNTPs、ThermoPol反應緩沖液和Bst?DNA聚合酶；或者還加有顯色劑SYBR?GREEN?I。

本發明的檢測流產鸚鵡熱衣原體的試劑盒的使用方法是：

a.用試劑盒中的兩對特異引物配制成LAMP反應液；

b.從被檢樣品中提取DNA；

c.以DNA為模板與LAMP反應液配制成LAMP反應混合物；

d.在LAMP反應混合物加入Bst?DNA聚合酶進行LAMP反應；

e.LAMP反應終止后進行瓊脂糖電泳，根據反應產物電泳后能否呈現清晰的梯度條帶判定被檢樣品的陽性和陰性；或者加入顯色劑SYBR?GREEN?I直接肉眼觀察，若反應液呈現綠色，可判定樣品中含有流產鸚鵡熱衣原體；若反應液呈現橙色，則判定樣品中不含流產鸚鵡熱衣原體。