[發明專利]一種含有loxP-kanr-loxP片段的重組質粒載體p18-kan±的構建方法

無效

• 申請號: 201110142843.1
• 申請日: 2011-05-30
• 公開（公告）號: CN102250937A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發明（設計）人: 原韜;沙長青;谷軍;張曉彥;陳兵;趙曉龍
• 申請（專利權）人: 黑龍江省科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N15/64
• 分類號: C12N15/64
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 金永煥

技術領域

本發明涉及一種重組質粒載體的構建方法。

背景技術

在進行真核生物基因敲除、替換等實驗過程中，往往會用到kan^r基因作為篩選標記，應用loxP位點作為去除抗性標記基因工具位點。在實際應用中，這一功能片段通常是應用融合PCR等互補PCR手段與目的基因重組連接的。但是，在實際操作中往往會因為PCR錯配及引物特異性等不足，使得連接失敗或產物基因失活，最終導致實驗失敗。

發明內容

本發明的目的在于提供一種含有loxP-kan^r-loxP片段的重組質粒載體p18-kan^±的構建方法。

含有loxP-kan^r-loxP片段的重組質粒載體p18-kan^±的構建方法按以下步驟進行：一、采用PCR技術從pUG6質粒中獲得loxP-kan^r-loxP片段；二、膠回收1.6Kb的loxP-kan^r-loxP片段，然后以2.7Kb的pMD18-T載體作為骨架，通過T-A末端連接，獲得連接產物；三、連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，然后涂布于氨芐抗性的LB固體培養基中進行培養，挑取陽性克隆，接種于氨芐抗性的LB液體培養基中震蕩培養后采用堿裂解法提取重組質粒，即完成含有loxP-kan^r-loxP片段的重組質粒載體p18-kan^±的構建。

本發明利用pMD18-T載體作為模板，向其多克隆位點上引入loxP-kan^r-loxP基因片段，同時構建出一對連接方向相反的重組質粒，該質粒loxP-kan^r-loxP位點兩端具有多個常用酶切位點，外源基因便于與loxP-kan^r-loxP片段連接，為真核生物基因敲除、替換提供了新的操作途徑。

本發明PCR獲得loxP-kan^r-loxP基因片段，將其連入到質粒載體pMD18-T多克隆位點中，獲得重組質粒，經轉化、藍白篩選后獲得含有loxP-kan^r-loxP片段的重組質粒載體p18-kan^±，經PCR及酶切鑒定，結果與預期結果相符，測序結果顯示loxP-kan^r-loxP片段以兩個不同方向成功連入質粒中，含有loxP-kan^r-loxP片段的重組質粒載體p18-kan^±構建成功。

具體實施方式

本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式，還包括各具體實施方式間的任意組合。

具體實施方式一：本實施方式含有loxP-kan^r-loxP片段的重組質粒載體p18-kan^±的構建方法按以下步驟進行：一、采用PCR技術從pUG6質粒中獲得loxP-kan^r-loxP片段；二、膠回收1.6Kb的loxP-kan^r-loxP片段，然后以2.7Kb的pMD18-T載體作為骨架，通過T-A末端連接，獲得連接產物；三、連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，然后涂布于氨芐抗性的LB固體培養基中進行培養，挑取陽性克隆，接種于氨芐抗性的LB液體培養基中震蕩培養后采用堿裂解法提取重組質粒，即完成含有loxP-kan^r-loxP片段的重組質粒載體p18-kan^±的構建。

本實施方式中pUG6質粒、大腸桿菌DH5α感受態細胞、pMD18-T載體均為購買得到(NewEngland?Biolabs?Inc.，MA，USA)；本實施方式在具體操作中涉及使用的各種反應試劑或試劑盒均為購買得到(寶生物工程有限公司)，且使用均按說明書操作。

本實施方式步驟二中連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，然后涂布于氨芐抗性的LB固體培養基中進行培養的具體過程：將大腸桿菌DH5α感受態細胞從-70℃取出，在冰上融化后加入5μl連接產物，冰中放置30分鐘，然后42℃熱休克90秒，再冰浴2-3分鐘，加入37℃預熱的S.O.C培養基900μl，37℃振蕩培養1小時(160-200rpm)，然后4000r/min離心3分鐘，棄上清，保留200μl培養基，將沉淀重新混勻后，涂布于氨芐抗性的LB固體培養基中，37℃培養過夜。