[發(fā)明專利]一種具有蛋白酶抗性的木聚糖酶XynAHJ3及其基因

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110142554.1
• 申請(qǐng)日: 2011-05-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102220303A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-10-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃遵錫;周峻沛;董巖巖;唐湘華;李俊俊;許波;高雅潔;潘璐
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 云南師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/42
• 分類號(hào): C12N9/42;C12N15/56;C12N15/63;C12N1/19;C12N1/21
• 代理公司: 昆明正原專利代理有限責(zé)任公司 53100
• 代理人: 金耀生

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種具有SDS、乙醇和蛋白酶抗性的木聚糖酶XynAHJ3及其基因。

背景技術(shù)

植物細(xì)胞壁主要是由木質(zhì)素（18–30%）、纖維素（28–50%）及半纖維素（20–30%）等物質(zhì)組成。半纖維素是由D-木糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖或D-半乳糖以直鏈或支鏈聚合而成的多糖。木聚糖是半纖維素中最豐富的一種多糖，其主鏈由吡喃木糖以β-1,4?糖苷鍵連接而成，側(cè)鏈上具有阿拉伯糖、葡糖醛酸、乙醚、香豆酸和肉桂酸等。完全水解木聚糖需要多種酶的協(xié)同作用，包括內(nèi)切-1,4-β-D-木聚糖酶（endo-1,4-β-D-xylanase，EC?3.2.1.8）和β-D-木糖苷酶（β-D-xylosidase，EC?3.2.1.37）等（Collins?et?al.?FEMS?Microbiol?Rev,?2005,?29:?3–23.）。內(nèi)切-1,4-β-D-木聚糖酶可隨機(jī)地切割木聚糖的主鏈骨架，生成木糖或低聚木糖，被認(rèn)為是最重要的木聚糖酶和半纖維素酶之一。

根據(jù)氨基酸序列同源性，木聚糖酶主要?dú)w類于糖苷水解酶第10、11、39、43、52、62和67家族；內(nèi)切-1,4-β-D-木聚糖酶主要?dú)w類于糖苷水解酶第10和11家族，其廣泛存在于細(xì)菌、放線菌及真菌等的基因組中（Finn?et?al.?Nucleic?Acids?Res,?2008,?36:?D281–D288.）。目前，對(duì)木聚糖酶的研究多集中于木聚糖酶的pH活性、pH穩(wěn)定性、溫度作用范圍和熱穩(wěn)定性方面，還未見(jiàn)同時(shí)具有SDS、乙醇和蛋白酶抗性的木聚糖酶的報(bào)導(dǎo)。

內(nèi)切-1,4-β-D-木聚糖酶在飼料、食品、釀酒、紡織及造紙等領(lǐng)域都具有應(yīng)用價(jià)值。飼料中添加木聚糖酶，可顯著降低木聚糖分子大小，從而改善飼料性能并消除或降低因粘度增加而引起的抗?fàn)I養(yǎng)作用；造紙工業(yè)中添加木聚糖酶，可取代有毒的漂白用化學(xué)物質(zhì)但仍能使紙張達(dá)到漂白效果；食品中添加木聚糖，可改善食品性能；釀酒過(guò)程中添加木聚糖，可提高發(fā)酵效率、改善酒的色澤并增加酒精的產(chǎn)率；紡織業(yè)中添加木聚糖酶，可輔助原料脫膠等（Beg?et?al.?Appl?Microbiol?Biotechnol,?2001,?56:?326–338.）。目前，同時(shí)具有乙醇抗性、SDS抗性和蛋白酶抗性的木聚糖酶還未曾報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種具有SDS、乙醇和蛋白酶抗性的木聚糖酶XynAHJ3。

本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述木聚糖酶的基因。

本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。

本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。

本發(fā)明所述木聚糖酶XynAHJ3可得自列舍瓦里爾菌（Lechevalieria?sp.），如Lechevalieria?aerocolonigenes?ATCC?23870。XynAHJ3的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.?1所示。

該酶總共含367個(gè)氨基酸，其中N端23個(gè)氨基酸為其預(yù)測(cè)的信號(hào)肽序列?“MRSARLVIALFAAVALSAPPASA”（SEQ?ID?NO.?2）。

因此，成熟的木聚糖酶XynAHJ3的理論分子量為38.9kDa，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.?3所示。

本發(fā)明的木聚糖酶XynAHJ3的最適pH值為6.0，在pH12.0時(shí)仍具有25%以上的酶活；經(jīng)pH4.0–11.0的緩沖液處理1h，酶活剩余90%以上；最適溫度為70℃，在20℃和80℃下都具有酶活性；在50℃下穩(wěn)定，在60℃下的半衰期~60min；可水解各種底物（包括燕麥木聚糖、山毛櫸木聚糖、樺木木聚糖、木薯粉、玉米粉、麩皮、豆粕、棉粕和菜粕）而不水解纖維素；經(jīng)胰蛋白酶和蛋白酶K處理1h后，XynAHJ3仍能分別保持105.9%和99.7%的酶活；經(jīng)80%和95%（v/v）的乙醇處理1h后，XynAHJ3仍能分別保持98.3%和36.4%的酶活；10mM及100mM的SDS未能使XynAHJ3失活。

本發(fā)明提供了編碼上述木聚糖酶的基因xynAHJ3，該基因序列如?SEQ?ID?NO.?4所示。

DNA序列結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，木聚糖酶基因xynAHJ3編碼信號(hào)肽的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.?5所示。

木聚糖酶基因xynAHJ3編碼成熟肽的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.?6所示。