[發(fā)明專利]檢測皮膚活性物質(zhì)的檢測試劑盒和檢測皮膚活性物質(zhì)的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110142379.6
• 申請(qǐng)日: 2011-05-27
• 公開（公告）號(hào): CN102465182A
• 公開（公告）日: 2012-05-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 崔向兌;孫義東;李真锳;羅勇柱;金漢坤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 株式會(huì)社愛茉莉太平洋
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 北京潤平知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11283
• 代理人: 陳小蓮;周建秋

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種皮膚活性物質(zhì)檢測用試劑盒及利用該試劑盒檢測皮膚活性物質(zhì)的方法，具體地，涉及利用含有以長壽基因著稱的klotho基因的檢測試劑盒，從皮膚細(xì)胞中將誘導(dǎo)klotho基因表達(dá)的候選物質(zhì)分離、精制，從而檢測抗衰老及美白物質(zhì)等皮膚活性物質(zhì)的皮膚活性物質(zhì)檢測用試劑盒及利用該試劑盒檢測皮膚活性物質(zhì)的方法。

背景技術(shù)

皮膚隨著年齡的增長或者暴露在太陽光下而老化。隨著老化，表皮的角質(zhì)層脫落并更新所需要的時(shí)間延長，角質(zhì)層增厚，真皮由于彈力纖維和保濕成分的含量下降或排列變化而產(chǎn)生皺紋。迄今為止，為了阻斷引起皮膚衰老的原因中的一種光老化，人們對(duì)預(yù)防紫外線照射引起的皮膚變化進(jìn)行了各種研究。另外，人們還研究了防止隨著年齡增長的老化，即由遺傳調(diào)節(jié)的老化的各種方法。這些研究都集中在尋找統(tǒng)籌調(diào)節(jié)老化的機(jī)制上。

對(duì)klotho基因的研究就是其中之一。敲除(knock-out)klotho基因的小鼠出現(xiàn)伴隨1，25-(OH)₂D₃濃度上升出現(xiàn)動(dòng)脈硬化、血管鈣化、管組織鈣化、肺氣腫、活動(dòng)減退、生殖腺形成異常、不孕、皮膚萎縮、運(yùn)動(dòng)失調(diào)癥、低血糖癥及高磷酸血癥(Mutation?of?the?mouse?klotho?gene?leads?to?a?syndrome?resembling?ageing.Nature?1997；390，45-51)。與此相反，klotho蛋白的表達(dá)增加時(shí)，出現(xiàn)壽命增加、胰島素抗性增加及IGF-1抗性增加(Kurosu等，2005)。在人體中，也有報(bào)道稱klotho蛋白的單核酸多態(tài)性與壽命減少、骨質(zhì)疏松、中風(fēng)及冠狀動(dòng)脈疾病有關(guān)(Arking等，2002；Kawano等，2002；Mullin等，2005；Ogata等，2002；Yamada等，2005)。

根據(jù)之前的研究，klotho主要在人的腎臟表達(dá)，在胎盤、前列腺及小腸中也有表達(dá)。但在klotho越來越重要的情況下，迄今為止未見klotho在皮膚細(xì)胞，即角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或黑色素細(xì)胞中表達(dá)的報(bào)道。因此，也沒有對(duì)增加klotho的表達(dá)的物質(zhì)的研究的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的

本發(fā)明的目的在于，制備一種能夠在皮膚細(xì)胞中增加klotho蛋白表達(dá)的試劑盒，并利用該試劑盒測定在角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及黑色素細(xì)胞等皮膚細(xì)胞中的klotho蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)能夠檢測抗老化物質(zhì)及美白物質(zhì)等皮膚活性物質(zhì)，從而完成了本發(fā)明。

因此，本發(fā)明的目的在于提供一種通過在皮膚細(xì)胞中的klotho基因的表達(dá)與否，從而篩選皮膚活性物質(zhì)的檢測試劑盒及利用該試劑盒檢測皮膚活性物質(zhì)的方法。

技術(shù)方案

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種檢測皮膚活性物質(zhì)的檢測試劑盒，該試劑盒含有klotho蛋白基因、用于擴(kuò)增klotho蛋白基因的引物、探針和皮膚細(xì)胞，所述用于擴(kuò)增klotho蛋白基因的引物具有SEQ?ID?No：1和SEQ?ID?No：2所示的序列，所述探針具有SEQ?ID?No：3所示的序列，在所述皮膚細(xì)胞中能夠篩選能夠增加klotho蛋白表達(dá)量的物質(zhì)，從而檢測皮膚活性物質(zhì)。

此外，本發(fā)明還提供利用所述檢測試劑盒檢測活性物質(zhì)的方法。

有益效果

根據(jù)本發(fā)明的皮膚活性物質(zhì)檢測試劑盒，通過在皮膚細(xì)胞中的klotho基因的表達(dá)與否，可迅速簡便地篩選如抗老化物質(zhì)及美白物質(zhì)等皮膚活性物質(zhì)。

附圖說明

圖1a是在人胚胎腎臟細(xì)胞(HEK293)、角質(zhì)形成細(xì)胞(NHK)及成纖維細(xì)胞(NHF)中測定klotho蛋白的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果；圖1b是在人黑色素細(xì)胞中測定klotho蛋白表達(dá)的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果；此時(shí)，NHM-增強(qiáng)黑(NHM-promoblack)及NHM-DP是源自黑人的黑色素細(xì)胞，NHM-MP是源自亞洲人的黑色素細(xì)胞。

圖2是在人胚胎腎臟細(xì)胞(HEK293)、角質(zhì)形成細(xì)胞(NHK)及成纖維細(xì)胞(NHF)中檢測klotho蛋白表達(dá)量的圖。

圖3是角質(zhì)形成細(xì)胞經(jīng)視黃酸(RA：retinoic?acid)及視黃醇(ROL：retinol)處理后，在第2天及第8天檢測klotho蛋白表達(dá)量的圖。

具體實(shí)施方式