[發(fā)明專利]半定量同時檢測cTnI和Myo的免疫層析試紙條及其制備

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110142274.0
• 申請日: 2011-05-30
• 公開（公告）號: CN102323422A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 毛紅菊;祝繼敏;金慶輝;趙建龍;朱大年
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/531
• 代理公司: 上海泰能知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 31233
• 代理人: 黃志達;謝文凱

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于cTnI和Myo的檢測領(lǐng)域，特別涉及一種半定量同時檢測cTnI和Myo的免疫層析試紙條及其制備方法。

背景技術(shù)

急性心肌梗死(acute?myocardial?infarction，AMI)是心血管系統(tǒng)的急危重癥，發(fā)病率高，預(yù)后較差，死亡率高。早期快速的診斷對于該病及時治療及預(yù)后具有重大意義，是檢驗醫(yī)學(xué)中一個重要的研究方向。在急性心肌梗死的早期診斷中，肌鈣蛋白I(cardiac?troponin?I，cTnI)和肌血球素(myoglobin，Myo)的聯(lián)合檢測有著重要的診斷指導(dǎo)意義。cTnI是存在于心肌細胞肌絲中的一種心肌調(diào)節(jié)蛋白，它是AMI發(fā)生時較為特異的一種蛋白。它在正常人血液中含量很低，約為20.4pg/ml。在AMI發(fā)生2.2-6.8小時，它的濃度開始升高，大約在11.2小時達到峰值195.9ng/ml。Myo是目前公認的檢測早期心肌損傷的較好的指標之一，廣泛存在于心肌和骨骼肌的橫紋肌中，它在正常人血液中含量小于50ng/ml，在AMI發(fā)病2-3小時后濃度開始升高，9-12小時達到峰值，24-36小時后恢復(fù)正常。雖然不是心肌損傷特異的標志蛋白，但是近來的研究表明，在心肌梗死發(fā)生早期(5小時內(nèi))，它與cTnI聯(lián)合檢測使AMI診斷的靈敏度、特異性得到了最佳體現(xiàn)，明顯優(yōu)于肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌鈣蛋白T(cTnT)、C反應(yīng)蛋白(CRP)和腦鈉尿多肽(BNP)等指標。

目前臨床上檢測血液中蛋白的方法主要有：放射免疫分析法(Radioimmunoassay，RIA)，生化免疫分析法，酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked?immunosorbent?assay，ELISA)和免疫熒光法(immunofluorescence，IF)等。但這些方法都有一定的局限性：RIA的優(yōu)點是結(jié)果精確，線性范圍寬，缺陷是操作過程復(fù)雜，樣品處理耗時，同時，放射性標記會對操作者造成傷害并對環(huán)境造成污染；生化免疫分析法雖已被廣泛應(yīng)用，但其檢測靈敏度較差；ELISA則由于方法間差異較大，導(dǎo)致結(jié)果不均一，且線性范圍較窄，此外，因為其操作復(fù)雜，不適于做單人份或少量標本的檢測；IF中熒光強度隨pH值和熒光燃料與抗體的比例而改變，難以定量反映抗原-抗體的結(jié)合。因此建立簡單、特異、快速、便捷的多蛋白檢測方法就顯得尤為重要，這不僅能降低病人的診斷費用，更重要的是能夠節(jié)省時間，從而盡快對病人開展治療。

近年來，試紙條檢測技術(shù)的發(fā)展為生化以及醫(yī)學(xué)快速檢測蛋白提供便捷的途徑。然而臨床醫(yī)學(xué)中現(xiàn)有的試紙條法多采用單蛋白的檢測方式，不僅增加檢測成本，更浪費檢測樣品；同時，由于檢測靈敏度低(通常為1ng/ml)，難以對疾病早期的一些微量蛋白標志物進行檢測，也很難同時檢測兩種豐度差異較大的蛋白，從而最終延誤治療時間。目前，提高靈敏度不是通過對樣品預(yù)先處理(延長檢測時間)，就是使用熒光技術(shù)(需要額外熒光檢測儀)來實現(xiàn)。生物素-鏈親和素系統(tǒng)(biotin-streptavidin?system，BSS)是70年代后期開始廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)，并得到迅速發(fā)展的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。由于它具有生物素與鏈親和素之間高度親和力及多級放大效應(yīng)，并與膠體金、熒光素、酶、同位素等免疫標記技術(shù)有機地結(jié)合于一體，使各種免疫分析的特異性和靈敏度進一步提高。BSS已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)實驗和研究的各個領(lǐng)域，用于微量抗原、抗體及受體的定量、定性檢測及定位觀察研究。但目前在試紙條上的應(yīng)用也是結(jié)合熒光技術(shù)，不僅增加了檢測成本，還需要額外的熒光檢測儀。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種半定量同時檢測cTnI和Myo的免疫層析試紙條及其制備方法，該試紙條對兩個豐度差異較大蛋白同時進行檢測，為臨床上心肌梗死的快速診斷提供了極大的便利，解決和彌補傳統(tǒng)免疫試紙條技術(shù)靈敏度低，同時檢測多蛋白時線性范圍窄的缺陷。

本發(fā)明的一種半定量同時檢測cTnI和Myo的免疫層析試紙條，包括底板、硝酸纖維素膜、第一結(jié)合墊、第二結(jié)合墊、樣品墊和吸水墊，其特征在于：硝酸纖維素膜上預(yù)包被有心肌肌鈣蛋白I?cTnI包被抗體(檢測線，T1)、肌血球素Myo包被抗體(檢測線，T2)和羊抗鼠IgG(質(zhì)控線，C1)，第一結(jié)合墊預(yù)包被有cTnI捕獲抗體膠體金探針cTnI-AuNP和Myo捕獲抗體納米金探針Myo-AuNP，膠體金探針結(jié)合有生物素化的DNA，第二結(jié)合墊預(yù)包被有鏈親和素納米金探針SA-AuNP。

本發(fā)明的一種半定量同時檢測cTnI和Myo的免疫層析試紙條的制備方法，包括：

(1)將樣品墊(SK06，金標公司)置于樣品墊處理液中浸泡后干燥，即得經(jīng)預(yù)處理的樣品墊；