[發明專利]一株H9N2禽流感病毒疫苗株及其在免疫保護上的應用

無效

• 申請號: 201110140410.2
• 申請日: 2011-05-27
• 公開（公告）號: CN102399754A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發明（設計）人: 許傳田;張秀美;胡北俠;魯梅;顏世敢;楊少華;張琳
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;A61K39/145;A61P31/16;G01N33/86;C12R1/93
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 苗峻

技術領域

本發明涉及動物病毒學領域，本發明提供了一株H9N2禽流感病毒疫苗株，其實際上為一株自然重組的雞源H9N2禽流感病毒毒株，且提供了該疫苗株的篩選過程及其在免疫保護特別是制成滅火疫苗后在SPF雞上的免疫效果分析。?

背景技術

禽流感病毒(AIV)隸屬于正粘病毒科A型流感病毒屬，基因組分為8個節段。核酸總長度約為13.6kb，編碼至少11個病毒蛋白。由于AIV負鏈、分節段的RNA病毒性質，病毒很容易發生變異并不斷的突破其感染宿主的種屬障礙，引起新的流感流行。AIV據其致病性可分為高致病性AIV(Highly?Pathogenic?Avian?Influenza?virus，HPAlV)和低致病性AIV(Low?Pathogenic?Avian?Influenza?virus，LPAIV)，感染家禽的HPAIV和LPAIV分別以H5和H9亞型為主。?

H9N2亞型流感屬于低致病性流感病毒，但它的危害卻不容忽視。H9N2AIV在世界范圍內廣泛存在，在北美，H9N2AIV主要存在于海鳥和野鴨體內(Kawaoka?et?al.1988；Sharp?et?al.1993)。1966年，H9N2AIV開始在美國火雞群中廣泛暴發流行(Homme?et?al.1970)，1981至1996年美國連續爆發過16次H9N2AIV感染火雞群事件(Alexander?2000)。?

1994年，陳伯倫等在廣東省某雞場分離到6株H9N2亞型AIV(陳伯倫et?al.1994)，將這些病毒實驗室接種雞，表現為典型的臨床癥狀，但不引起雞死亡。這次AI發生之后，H9N2?AIV在我國一直呈上升趨勢，嚴重制約了養禽業的發展，同時，眾多的人和豬暴露于H9N2?AIV中，也增加了人和豬感染H9N2?AIV的可能性。?

近年來，隨著我國養殖業飛速發展，我國成為養殖大國，但還不是養殖強國。H9N2亞型是目前我國雞群中存在的AIV的主要亞型，占禽流感總發病率90％以上。H9N2亞型禽流感發病后雖然致死率不高(一般不超過30％)，但常導致呼吸道癥狀，蛋雞的產蛋下降，并使雞群易繼發嚴重的呼吸道疾病，影響家禽生產性能；肉雞感染后造成免疫抑制，容易造成繼發感染和混合感染，從而給肉雞養殖業造成巨大經濟損失。我國在禽流感的防控中采取了疫苗免疫和撲殺的政策，實踐證明該政策對控制禽流感的大規模流行起到了重要作用。積極開展流行病學調查，密切追蹤AIV的分子進化和抗原變異，選擇免疫保護性好的H9N2流感病毒疫苗株，才能保證疫苗良好的免疫效果。?

眾所周知，禽流感病毒變異非常快，因此及時的發現新的毒株研究其特性，并最終篩選出可以作為疫苗株的毒株是保證禽流感疫苗效果的最重要方式之一。?

發明內容

本發明的發明人提供了一株H9N2禽流感病毒疫苗株，其實際上是一株自然重組的A/Chicken/Shangong/SG2/2009(簡稱CK/SD/SG2/2009)(H9N2)禽流感病毒毒株，并提供了該毒株的全基因組序列，闡明其8個基因片段與國內經典的H9N2病毒株在系統進化上的差異，從而為H9N2病毒的分子進化和流行病學研究提供資料；同時提供了該毒株作為疫苗株的試驗數據和指標，以明確其作為H9N2流感疫苗備用毒株的可行性。?

發明人對該毒株進行了生物保藏，其保藏編號為：CCTCC?NO：V201030。?

該病毒的全基因組序列測定表明，其PB2基因隸屬于CK-SH-Y-2008-like譜系，其它七個基因屬于CK-SH-F-98-like譜系，進而這是一株重組H9N2禽流感病毒毒株。?

針對該病毒遺傳背景，發明人采用的分離及鑒定方法如下：?

病毒分離鑒定：?

取發病雞的內臟器官(肝、腎、脾等)加入適量的滅菌生理鹽水研磨成勻漿，8000轉/分鐘(rpm)離心8分鐘，吸取上清。然后加入青霉素和鏈霉素4℃處理1小時后，取上清經尿囊腔接種9-10日齡的SPF雞胚，0.2ml/枚，置孵化器中培養。每天觀察兩次，棄除24小時內的污染胚，收取死亡胚的尿囊液。通過血凝試驗檢測尿囊液有無血凝性，收集有血凝性尿囊液，通過血凝抑制試驗(HI)和PCR方法鑒定為H9N2亞型禽流感。血凝抑制試驗用到的H5、H9、新城疫(ND)標準抗體購自哈爾濱獸醫研究所。?

純化：?

把鑒定好的病毒在9-10日齡SPF雞胚上連續傳三代純化病毒，無菌收集尿囊液并且分裝在凍存管中在-70℃冰箱保存備用。?